制備MRI雙靶向分子示蹤劑細胞黏附分子-微米級氧化鐵顆粒及體外實驗

黎 成，卜 超，蘇 赟，鐘嘉寶，潘愛珍，高明勇，黃穗喬*

(1.佛山市第一人民醫院放射科，廣東 佛山 528000；2.中山大學附屬孫逸仙紀念醫院放射科，廣東 廣州 510120；3.佛山市南海區第五人民醫院內科，廣東 佛山 528200)

放射性腦損傷(radiation-induced brain injury， RBI)是頭頸部惡性腫瘤經放射治療后出現的嚴重臨床并發癥之一，在放射治療患者中發病率約1.9%～2.5%[1]，嚴重影響其生存質量及預后[2]，但放射治療仍是部分頭頸部惡性腫瘤的首選治療手段，使早期診斷及治療RBI成為亟待解決的問題。目前診斷RBI主要依靠臨床病史及影像學檢查。近年來，fMRI技術和PET的發展及應用提高了RBI的早期檢出率及診斷準確率，但是其圖像空間分辨率低，缺乏特異性[3-5]。本課題組在前期研究[6]中應用細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1)抗體鏈接熒光標記的微米級氧化鐵顆粒(microparticles of iron oxide， MPIO)，合成單靶向分子示蹤劑ICAM-MPIO，發現對早期診斷RBI有一定應用價值。在此基礎上，本研究利用ICAM-1抗體、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1， VCAM-1)抗體及MPIO制備MRI單靶向分子示蹤劑ICAM-MPIO、VCAM-MPIO及雙靶向分子示蹤劑細胞黏附分子(cell adhesion molecule， CAM)-MPIO，評估其與體外細胞結合的特異性及效率，為后續動物實驗及靶向藥物研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926(武漢普諾賽生命科技有限公司)；MPIO(Bangs Lab，1毫升/支，質量濃度10 mg/ml，粒徑0.50～2.00 μm(平均約1.63 μm，鐵含量約42.5%)；小鼠抗人ICAM-1/VCAM-1單克隆抗體及相應的二抗、DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole， 4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α；R&D System)；瓊脂糖(上海碧云天生物科技有限公司)；2-嗎啉乙磺酸(Sigma)；磁珠分選儀(Invitrogen)；CO2培養箱(HeraeusBB16)；倒置相差顯微鏡(Nikon)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)。

1.2 制備 MRI靶向分子示蹤劑ICAM-MPIO、VCAM-MPIO及CAM-MPIO 加入2-嗎啉乙磺酸激活MPIO微球表面的羧基基團，再分別加入小鼠抗人ICAM-1、VCAM-1單克隆抗體(制備ICAM-MPIO、VCAM-MPIO)，或同時加入小鼠抗人ICAM-1和VCAM-1單克隆抗體(制備CAM-MPIO)，37℃下不斷旋轉孵育20 h，待其充分反應后加入終止反應液。采用磁珠分選儀收集MPIO，棄去上清液，加入pH=7.4的PBS緩沖液(含0.5%牛血清白蛋白和0.05%吐溫20)充分阻斷未反應的活性羧基位點，最后用儲存液重懸并4℃條件下保存。以上所有操作均在避光條件下完成。

1.3 TNF-α激活人臍靜脈內皮細胞表面ICAM-1及VCAM-1抗體表達情況 將不同濃度(1、5、10、20、50 ng/ml)TNF-α加入人臍靜脈內皮細胞中(實驗組)，對照組則加入等量PBS緩沖液；以Western-Blot法檢測細胞表面ICAM-1及VCAM-1抗體的表達，計算ICAM-1和VCAM-1與內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)的相對表達量。免疫熒光實驗中，實驗組的細胞加入10 ng/ml的TNF-α，對照組則加入等量PBS緩沖液，均分別加入ICAM-1、VCAM-1抗體及相應的二抗，用DAPI將細胞核染成藍色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核周圍綠色熒光、紅色熒光分布情況。

1.4 靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合普魯士藍染色實驗 將人臍靜脈內皮細胞分為3個實驗組(TNF-α激活人臍靜脈內皮細胞后分別與CAM-MPIO、VCAM-MPIO、ICAM-MPIO共同孵育)，對照組(無TNF-α+CAM-MPIO)及競爭抑制組(TNF-α+足量的游離ICAM-1及VCAM-1抗體+CAM-MPIO，以阻斷細胞表面ICAM-1及VCAM-1抗體的結合位點)。實驗組及競爭抑制組細胞用濃度為10 ng/ml的TNF-α刺激人臍靜脈內皮細胞，對照組則加入等量PBS緩沖液，與相應靶向分子示蹤劑充分結合后，進行普魯士藍染色，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞表面鐵染色情況。

1.5 靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合免疫熒光實驗 實驗分組同1.4，實驗組及競爭抑制組細胞用濃度為20 ng/ml的TNF-α刺激人臍靜脈內皮細胞，對照組則加入等量PBS緩沖液，與相應靶向分子示蹤劑充分結合后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞周圍黃色熒光分布情況。利用Image J軟件(V1.8.0)測量各組細胞周圍黃色熒光面積。

1.6 靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合MR掃描 實驗分組同1.4，實驗組及競爭抑制組用濃度為10 ng/ml的TNF-α刺激人臍靜脈內皮細胞，對照組則加入等量PBS緩沖液，與不同濃度(0、0.1、1、2、5、10 μg/ml)的靶向分子示蹤劑充分結合，然后用2%瓊脂糖溶液(使用時加熱至液態)重懸，充分冷卻后進行MR掃描。

采用Philips Gvroscar Intera 1.5T MR掃描儀，掃描序列包括FSE序列T2WI及T2-mapping。T2WI：TR 2 000 ms，TE 100 ms，FOV 80 mm×80 mm，矩陣256×256，層厚2 mm；T2-mapping：TR 2 000 ms，TE 20 ms，FOV 80 mm×80 mm，矩陣256×256，層厚1.5 mm。采用Image J軟件處理T2-mapping圖像，觀察T2WI和T2-mapping偽彩圖。

2 結果

2.1 TNF-α激活人臍靜脈內皮細胞表面ICAM-1及VCAM-1抗體表達情況 經Western-Blot實驗獲取各組條帶及分析灰度值，ICAM-1/GAPDH和VCAM-1/GAPDH相對表達量先隨TNF-α濃度增高而增高，TNF-α濃度為10 ng/ml時相對表達量最高，分別為對照組(濃度為0)的(2.38±0.71)倍和(2.67±0.67)倍，之后隨濃度升高而有所下降，見表1、圖1。

表1 實驗組不同濃度TNF-α刺激內皮細胞表面和對照組的VCAM-1及ICAM-1相對表達量(±s)

注：*：與對照組比較，P<0.05

圖1 不同濃度TNF-α刺激人臍靜脈內皮細胞表面ICAM-1及VCAM-1表達Western-Blot條帶圖

激光共聚焦顯微鏡下觀察，實驗組視野內藍色熒光的細胞核周圍可見彌漫分布不同強度的綠色熒光或紅色熒光，而對照組視野內藍色熒光的細胞核周圍僅見散在分布的點狀綠色熒光或紅色熒光(圖2)，實驗組的熒光強度均明顯強于對照組。

2.2 靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合普魯士藍染色結果 倒置相差顯微鏡下觀察，MPIO微球中的鐵顆粒被普魯士藍染液染成藍色，3個實驗組細胞表面見大量散在分布點狀藍染鐵顆粒，且CAM-MPIO組藍染鐵顆粒分布較ICAM-MPIO組、VCAM-MPIO組明顯增多，而對照組、競爭抑制組細胞周圍僅見散在少量點狀藍染鐵顆粒分布，見圖3。

2.3 靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合免疫熒光實驗結果 激光共聚焦顯微鏡下觀察，3個實驗組細胞周圍見明顯點狀、斑片狀黃色熒光，而對照組及競爭抑制組細胞周圍幾乎未見明確黃色熒光分布，見圖4。各組間細胞周圍黃色熒光面積總體差異有統計學意義(F=201.57，P<0.01)，對照組與競爭抑制組、ICAM-MPIO組與VCAM-MPIO組間差異均無統計學意義(P=0.98、0.56)，余組間兩兩比較差異均有統計學意義(P均<0.01)，見圖5。CAM-MPIO組的細胞周圍黃色熒光面積分別為ICAM-MPIO、VCAM-MPIO組的(2.00±0.31)倍和(2.46±0.45)倍。

2.4 靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合MRI結果 3個實驗組T2WI信號強度和T2值隨靶向分子示蹤劑濃度增高呈不同程度減低，以CAM-MPIO組減低為著；競爭抑制組及對照組T2WI信號強度及T2值略有減低；見圖6、7。

3 討論

RBI早期病理生理表現為照射野內腦組織的炎癥過程，主要為小膠質細胞激活，釋放大量促炎癥因子如白介素-1β、白介素-6、TNF-α，環氧合酶-2等，促炎因子、細胞因子分泌，介導炎癥細胞穿過內皮細胞間隙到達組織發揮作用，損傷腦組織[7]。在眾多細胞因子中，ICAM-1、VCAM-1發揮重要作用，研究[8-9]表明，在射線誘導下，ICAM-1、VCAM-1表達明顯上調，從而介導炎性損傷過程。本研究以TNF-α代替射線，誘導內皮細胞發生炎性損傷，結果顯示在TNF-α刺激下，內皮細胞表面ICAM-1及VCAM-1表達明顯上調，且呈濃度依賴性，與既往研究[6]結果一致，提示ICAM-1及VCAM-1可作為識別血管內皮細胞炎癥損傷的靶點，有望早期發現以此為病理基礎的病變如RBI等。

圖2 TNF-α刺激人臍靜脈內皮細胞免疫熒光實驗 A、B.ICAM-1表達,對照組(A)細胞核周圍見散在少量綠色熒光，實驗組(B)細胞核周圍見大量綠色熒光； C、D.VCAM-1表達,對照組(C)細胞核周圍見散在斑點狀紅色熒光，實驗組(D)細胞核周圍見大量紅色熒光

圖3普魯士藍染色顯示靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合情況 A～C.分別為CAM-MPIO組、VCAM-MPIO組和ICAM-MPIO組，均可見大量藍染的鐵顆粒位于細胞膜上，CAM-MPIO組最多； D、E.分別為競爭抑制組和對照組，均可見散在少量藍染的鐵顆粒

MPIO作為靶向分子示蹤劑載體，與ICAM-1或VCAM-1結合，已廣泛應用于分子MRI研究。Deddens等[10]觀察小鼠腦卒中模型，發現ICAM-MPIO的腦血管炎癥分子成像效果優于脂質體標記的釓對比劑；而McAteer等[11-12]發現雙靶向分子示蹤劑較單靶向分子示蹤劑更有助于動脈硬化斑塊的成像及活動性評估。

本研究采用化學縮合方法成功制備雙靶向分子示蹤劑CAM-MPIO及單靶向分子示蹤劑ICAM-MPIO、VCAM-MPIO。在靶向分子示蹤劑與內皮細胞結合實驗中，經普魯士藍染色發現TNF-α激活的內皮細胞周圍分布大量藍染MPIO微球，免疫熒光實驗發現被激活內皮細胞表面分布大量帶黃色熒光的MPIO微球，T2WI信號強度及T2值隨靶向分子示蹤劑濃度增加而減低，表明合成的靶向分子示蹤劑均可特異性地與被激活的內皮細胞結合，既可進行光學成像，又可進行MR成像。比較免疫熒光實驗各組細胞周圍的黃色熒光面積，CAM-MPIO組熒光面積明顯大于ICAM-MPIO、VCAM-MPIO組，提示雙靶向分子示蹤劑與內皮細胞結合數量多于單靶向分子示蹤劑，間接反映雙靶向分子示蹤劑與內皮細胞的結合效果優于單靶向分子示蹤劑，為下一步應用上述合成的雙靶向分子示蹤劑進行小鼠RBI模型無創性早期影像學診斷研究提供了理論基礎。

圖4免疫熒光實驗顯示靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合情況 A～C.分別為CAM-MPIO組、ICAM-MPIO組和VCAM-MPIO組，細胞周圍均見大量黃色熒光分布； D、E.分別為競爭抑制組和對照組，細胞周圍幾乎未見明確黃色熒光分布

圖5 免疫熒光實驗顯示靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合黃色熒光面積柱圖 (*：與CAM-MPIO組比較，P<0.01)

本研究的主要不足在于MPIO表面由惰性材料包被，在人體內不能被生物降解，至今尚未被食品藥品監督管理局(food and drug administration, FDA)批準用于人體研究，僅可用于動物實驗或離體實驗。目前已可利用FDA批準的可作為藥物載體的乳酸羥基乙酸共聚物(polylactide-co-glycolide， PLGA)和生物素包被MPIO成功合成靶向分子示蹤劑[13-14]，但尚未見應用于人體的研究。相信在不久的將來會找到可生物降解的材料包被MPIO合成靶向示蹤劑或作為靶向藥物載體用于人類，協助早期診斷及靶向治療疾病。

圖6 T2WI示靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合情況 圖7 T2-mapping偽彩圖示靶向分子示蹤劑與體外細胞特異性結合情況