基于SSR標記的地方品種糯性小玉米自交系指紋圖譜構建

倪維晨，李瑞霞，陶啟威，張 戟，畢研飛，錢春桃,4*

(1.南農大(常熟)新農村發展研究院有限公司，江蘇 蘇州 215500； 2.常熟市農業科學研究所，江蘇 蘇州 215500； 3.江蘇常熟國家農業科技園區管理委員會，江蘇 蘇州 215500； 4.南京農業大學，江蘇 南京 210095)

隨著社會經濟的發展，鮮食玉米如糯玉米、甜玉米等的遺傳改良及新品種選育工作得到高度重視，新品種不斷涌現，鮮食玉米市場異常活躍。糯性鮮食小玉米作為常熟地區農業生產上的特色農作物之一，已經成為地方農業產業結構升級的品牌產品，在地方特色農產品品牌塑造工程的“董浜鄉情十二品”中占據著重要位置，通過網絡銷售和鄉村旅游節銷售推介，已經成為常熟市董浜鎮農業供給側改革的一個重要抓手。

糯性鮮食小玉米品種自交系常年種植面積在333 hm2以上，具有豐富的優異基因資源，但至今還未能系統、科學地進行研究、開發和保護。DNA分子標記已經在一些地方玉米品種、水稻、小麥等[1-2]主要農作物的種質資源研究中得到廣泛應用。鮮食玉米遺傳育種及生產應用發展迅速，但分子標記技術在種質鑒定中的應用與普通玉米相比仍顯落后。

簡單序列重復SSR標記是建立在PCR反應基礎之上的一種遺傳標記，相比其他常用技術具有穩定性好、準確性高等優點，被廣泛運用于農作物品種鑒定及指紋圖譜構建中[3]。本研究采用SSR分子標記技術對常熟地區10份地方糯性鮮食小玉米品種進行分析，構建了10個地方糯性鮮食小玉米品種的指紋圖譜，建立了一套適合常熟地區鮮食小玉米品種SSR分子標記的分析技術體系，以期為常熟市鮮食糯性小玉米品種的遺傳資源評價、品種保護提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

常熟市農業科學研究所提供其糯性小玉米自交系10份。糯性小玉米自交系在室內用恒溫箱沙床培養，待玉米生長到3葉1心時，隨機取5株同一葉位的葉片混合，放于-80 ℃冰箱保存備用。自交系名稱編號見表1。

表1 10份糯性小玉米名稱及編號

1.2 DNA提取

利用DNA快速提取試劑盒(DN15-新型植物基因組DNA快速提取試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司)提取玉米葉片總DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠檢測提取的DNA質量，挑選條帶亮、清晰的DNA保存備用。

1.3 SSR引物篩選

結合MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/data_center/ssr)數據庫和前人對玉米自交系SSR核心引物的研究結果，篩選出均勻分布于玉米10條染色體上的30對擴增條帶清晰、重復性好、多態性豐富的引物。引物由南京鐘鼎生物技術有限公司合成。

1.4 標記分析

PCR擴增體系配制在冰上完成，反應體積為15 μL，其中包括：10×PCR緩沖液 1.5 μL，5 U·μL-1Taq酶0.225 μL，25 mmol·L-1Mg2+0.9 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.3 μL，0.01 mmol·L-1引物為0.6 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.875 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min，1個循環；94 ℃變性1 min，47～60 ℃復性45 s(根據引物退火溫度調整)，72 ℃延伸1 min，32個循環；72 ℃延伸10 min，1個循環；4 ℃保存待檢測。反應產物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，銀染顯色照相和數據統計分析。

1.5 數據統計

SSR擴增產物以0、1統計建立數據庫，在相同位置上，有條帶的記為1，沒有條帶的記為0；以簡單相配系數計算自交系的遺傳相似值[4]，GS=m/(m+n)，m表示基因型共有帶數目；n表示基因型間差異帶數目。利用Ntsys 2.1軟件進行數據處理，按UPGMA方法對供試自交系進行聚類。

2 結果與分析

2.1 糯性小玉米的分子標記

利用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測提取的DNA質量，如圖1所示，DNA條帶清晰，較為集中，拖尾不明顯，沒有降解。

圖1 DNA的電泳檢測結果

2.2 SSR標記檢測結果

利用30對SSR標記對10個糯性小玉米自交系進行PCR擴增，8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測和銀染顯影分析SSR擴增產物。共篩選到20對SSR引物在所有試驗材料中有多態性的譜帶，并且條帶較為清晰。圖2為引物P6-P10擴增結果。

圖2 引物P6-P10的擴增結果

對篩選的20對出多態引物條帶進行統計分析。如表2所示，20對引物共檢測到70個等位基因變異，不同位點引物的等位基因變異數為2～6個，引物P2、P3、P10、P21、P29最少，檢測到2個；引物P6、P7最多，檢測到6個；平均每對引物等位基因變異數為3.5個。

2.3 引物的確定

評價20對引物在10份糯性小玉米品系間的帶型清晰度、多態性高低和帶型統計的難易程度，作為最終鑒定的候選引物，再根據入選引物在每條染色體上均勻分布的原則，最終確定bnlg2291k4、umc1545y2、bnlg161k8、umc1506k12、umc2084w2、umc1536k9、umc1335y5、umc2115k3、umc1489y3、bnlg240k1等10對引物作為鑒定糯性小玉米的鑒定引物。10對引物對10份糯性小玉米品系的檢測結果表明，10對引物共檢測出39條帶，每對引物檢測2～6條帶，平均3.9條帶，其中bnlg161k8、umc1506k12條帶數最多為6個。

2.4 DNA數字指紋建立

以多態性高、重復性好、帶型易區分統計的原則確定了10對核心引物，將SSR-PCR擴增產物特征譜帶進行0、1數字化，建立數據庫(表3)。特征條帶大小范圍在140～400 bp，相似性在0.1～0.7(表4)。聚類分析表明，10對引物可以將10份糯性小玉米品系區分開。根據趙久然等[5]提出的計算玉米指紋圖譜概率的公式：P=1/N，對自交系N=n，N為自交系數，n為所用引物的等位基因數。本文確定的10對核心引物組合可區分的最大自交系數N=2×3×6×6×4×2×4×5×3×4=414 720，出現相同指紋圖譜的概率P=2.41×10-6，因此可利用這組引物對構建常熟市糯性小玉米的自交系指紋。

表2 20對SSR引物在10個糯性小玉米品系中檢測到的等位基因數

表3 10份糯性小玉米品系DNA指紋數據

表4 10份糯性小玉米品系的遺傳相似系數

3 討論

種質資源是農作物新品種選育的重要物質基礎，長期的育種工作實踐證明，一個突破性品種的育成往往來自于一個特異性狀基因的利用[6]。玉米地方品種經長期的自然和人工選擇，積累了大量的適應當地生態條件的優良基因，形成了極其豐富多彩的玉米資源類型以及部分具有獨特優良性狀的資源材料[7]。因此，對地方玉米種質資源的保護和發掘及推動全國玉米發展具有重要的意義。

隨著分子標記技術的快速發展，分子標記技術在農作物親緣關系和分類研究、品種的真實性和純度鑒定、新品種指紋圖譜構建等方面得到廣泛應用，并發揮著重要的作用[8]。其中，SSR分子標記以多態性高、重復性好、費用較低等特點，在玉米的指紋圖譜構建、品種鑒定等方面應用廣泛。盧媛等[9]利用40對玉米SSR核心引物對供試品種進行DNA指紋鑒定，確定滬玉糯3號玉米的真實性，并篩選出6對共顯性SSR核心引物，用于滬玉糯3號玉米的純度鑒定；姚丹青等[3]利用篩選的25對玉米SSR引物，構建了上海地區32個玉米品種的DNA指紋圖譜；邸仕忠等[10]利用SSR分子標記對60種玉米自交系構建指紋圖譜，并篩選出10對引物用于玉米自交系的鑒定；呂學高等[11]利用40對玉米SSR核心引物，對浙江省90份玉米地方種質資源進行聚類分析，將其分為四大類別。本研究利用20對SSR引物對10份糯性小玉米自交系進行遺傳多樣性分析，共檢測到70個等位變異，平均等位基因變異數為3.5，等位基因變異范圍是2～6；遺傳相似性在0.1～0.7。本研究的等位基因數與國內玉米相關研究相近，低于國外研究結果[12]。出現這種結果的可能原因是本次試驗選用的是地方糯性小玉米品種，品種范圍較小，種質遺傳基礎相對狹窄。

本研究確定的10對SSR引物作為核心引物構建了常熟地區10份糯性小玉米自交系的指紋圖譜，這10對引物的擴增條帶2～6條，帶型統計簡單易統計，可區分的最大自交系數N=4.15×105，出現相同指紋圖譜的概率P=2.41×10-6，檢測10份自交系的DNA指紋圖譜沒有任何兩份材料帶型完全相同。因此，可以利用這10對引物對常熟地區糯玉米自交系進行鑒定。但篩選出來的10對引物與邸仕忠等[10]、劉濤等[13]、李世風等[14]的研究結果存在差異，這可能與所處不同地區、選用不同的玉米材料多態性存在差異有關。

本研究利用SSR標記技術進行指紋圖譜采集，首次構建了10份糯性小玉米品種指紋圖譜，為常熟當地玉米品種快速檢測奠定了基礎，為地方品種管理、品牌形成、農民的利益維護提供強有力的技術支撐，有利于保護地方優秀種質資源，促進糯性鮮食小玉米研究及市場的健康發展。