農業投入品中隱性成分篩查方法及應用

汪志威，周思齊,，李非里，吳聲敢，楊桂玲，齊沛沛，王祥云，狄珊珊，徐浩，王新全*

(1.浙江省農業科學院農產品質量標準研究所 農業農村部農藥殘留檢測重點實驗室 浙江省農藥殘留檢測與控制研究重點實驗室，浙江 杭州 310021； 2.浙江工業大學 環境學院，浙江 杭州 310021)

農業投入品中非法添加農藥隱性成分，不僅嚴重擾亂農藥行業正常秩序，而且極易引發食品安全問題。對這類“假農藥”，種植戶和地方監管部門缺乏甄別方法，一旦被使用易引起重大食品安全風險；因此，此類“假農藥”問題在近年來受到廣泛的關注[1-2]。

農藥隱性成分的添加目標是“藥效好、見效快”，歷年案例報告顯示隱性添加成分以殺蟲劑居多，主要包括添加高毒禁限用農藥、擬除蟲菊酯類農藥，非法添加未過專利保護期的農藥，以及生物農藥添加化學農藥等形式。違法者通過助劑復配、農資贈品等方式添加農藥隱性成分，方式隱蔽，增加了監管難度。同時，由于農藥種類繁多，而隱性添加成分目標難以確定，這也大大增加了篩查難度。

喬成奎等[3]利用液相色譜串聯三重四級桿質譜(LC-MS/MS)建立了農藥產品中30種高風險隱性成分的篩查方法；李俊等[4]利用氣相色譜串聯三重四級桿質譜(GC-MS/MS)建立測定農藥中32種隱性添加成分的分析方法。上述方法的優勢在于靈敏度高、快速，但只能針對特定種類的隱性添加成分進行檢測，難以“一網打盡”。陸劍飛[5]提出了基于氣相色譜篩選—氣相或液相色譜驗證—質譜確證進行農藥隱性成分篩查的技術路線，并提供了鑒定方法及案例，方法系統性高、漏檢率低，但對檢測人員的技術要求較高，且篩查周期較長。目前，農藥隱性成分雖然受關注度很高，但其檢測方法的改進報道卻極少。

本研究擬建立基于GC-MS/MS和LC-MS/MS的農業投入品中農藥隱性添加成分篩查方法體系。該方法篩查目標范圍廣、速度快，可有效滿足農藥隱性成分的篩查要求。現總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

用于篩查的農藥標準品分別購自農業農村部環境質量監督檢驗測試中心(天津)、上海安譜公司和德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，丙酮和乙腈試劑購自Honeywell公司。

用于篩查隱性成分的農業投入品來自“一品一策”等風險評估調研的浙江省內農資店和生產基地。

1.2 前處理方法

調研獲得農業生產中使用的殺蟲劑、殺菌劑，以及具有植物生長調節劑功能的農業投入品。對包裝袋正反面進行拍照，做好產品信息記錄。記錄完畢后，振蕩混勻樣品，準確稱取0.1 g樣品，用10 mL乙腈溶解于15 mL玻璃刻度管中(乙腈無法溶解樣品時，用5 mL乙腈溶液超聲5 min，重復2次，合并上清液)，混勻提取液作為母液(10 g·L-1)備用。

1.2.1 目標物篩查

GC-MS/MS分析。將母液用丙酮試劑稀釋至0.1 g·L-1，混勻，過0.22 μm有機膜后用GC-MS/MS的MRM(多反應監測)模式對農藥隱性成分進行篩查，篩查參數見表1～2。

表1 敵敵畏等GC-MS/MS篩查參數及單離子檢測掃描(SIM)和多反應監測(MRM)方法

LC-MS/MS分析。將母液用乙腈和水混合溶液(體積比1∶1)稀釋至0.01 g·L-1，混勻，過0.22 μm有機膜后用LC-MS/MS的MRM模式對農藥隱性成分進行篩查，篩查參數見表3。

表2 苯硫威等GC-MS/MS篩查參數及單離子檢測掃描(SIM)和多反應監測(MRM)方法

上機溶液進樣前如顏色仍特別深，為保護質譜儀器，可取1.5 mL上機液于QuEChERs 2 mL凈化小粉管中[內含50 mg C18，50 mg PSA(N-丙基乙二胺)和150 mg硫酸鎂]，在離心力為4 766g的條件下離心3 min，取上清液過0.22 μm有機膜后上機。

1.2.2 無目標篩查

取0.5 mL母液，加入0.5 mL丙酮混勻，通過氣相色譜-質譜在全掃描模式下篩查，掃描質量數(m/z)為45～500。在無目標篩查時，將未加農業投入品的乙腈稀釋液作為空白對照，用于扣除本底。

1.3 儀器條件

GC-MS/MS：TSQ quantum氣相色譜串聯質譜(Thermo，USA)，色譜柱為安捷倫DB-5 ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。程序升溫條件：初溫50 ℃，以30 ℃·min-1升溫至140 ℃，再以10 ℃·min-1升溫至300 ℃，保留5 min。前進樣口溫度為230 ℃，不分流進樣，進樣體積1 μL。

LC-MS/MS：島津超高效液相色譜儀LC-30A與三重四極桿質譜儀AB ScieX Triple Quad 4500，色譜柱為Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流動相為甲醇和水，其中，甲醇和水中均含有5 mmol·L-1甲酸銨的甲醇/水混合溶液(甲醇與水的體積比為9∶1)，流速0.25 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進樣體積為2 μL，等度洗脫。

1.4 計算方法

Y=100CtfV÷m。

(1)

式(1)中，Y代表農業投入品中隱性成分的質量分數(%)，Ct是進樣瓶中農藥隱性成分的濃度(mg·L-1)，f是母液到進樣溶液的稀釋倍數，V是農業投入品母液定容體積(10 mL)，m是農業投入品稱量質量(0.1 g)。

表3 LC-MS/MS篩查參數及方法

2 結果與分析

2.1 國家禁限用農藥參數匯總

近年來，我國多部委陸續頒布了蔬菜、果樹、茶葉、中草藥材等范圍的高毒高殘留農藥的禁限用公告。這些農藥中可以通過三重四級桿串聯質譜進行分析已經或即將禁限用農藥清單(統計信息截至2018年12月12日)如下：六六六、滴滴涕、除草醚、艾氏劑、狄氏劑、內吸磷、硫環磷、氯唑磷、氰戊菊酯、丁酰肼(比久)、甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、久效磷、磷胺、氟蟲腈、苯線磷、地蟲硫磷、甲基硫環磷、硫線磷、蠅毒磷、治螟磷、特丁硫磷、滅多威、滅線磷、涕滅威、氧樂果、水胺硫磷、三唑磷、毒死蜱、殺撲磷、氟苯蟲酰胺、克百威、甲基異柳磷、甲拌磷、三氯殺螨醇、乙酰甲胺磷、樂果、丁硫克百威、硫丹。一旦添加這些農藥隱性成分，極易導致農藥殘留超標。

2.2 農藥隱性成分篩查參數的確定

篩查參數的確定對于有效篩查農業投入品中的農藥隱性成分至關重要。禁限用農藥在農產品中的限量值通常極低，一旦使用極易引起農產品農藥殘留超標，因此在隱性成分篩查時禁限用農藥一直是重點關注目標。另外，對于某些綠色食品生產企業，一旦使用含有化學農藥成分的生物農藥，也將給農戶帶來重大經濟損失，因而高效化學農藥也是隱性成分篩查的重點目標。本篩查方法參數的確定綜合了禁限用農藥清單、農業農村部農藥殘留例行檢測參數，以及歷年篩查案例，確定隱性成分篩查農藥參數共215個(部分代謝產物以農藥母體計)，詳細參數如下：敵敵畏、茚蟲威、速滅磷、氟鈴脲、甲硫威、克百威(含三羥基克百威)、氟樂靈、氯苯胺靈、百治磷、惡蟲威、異口惡草松、治螟磷、蔬果磷、戊菌隆、甲拌磷、六六六、內吸磷、西瑪津、五氯硝基苯、特丁硫磷、二嗪磷、地蟲硫磷、磷胺、乙烯菌核利、嘧霉胺、七氟菊酯、敵惡磷、乙拌磷、百菌清、皮蠅磷、異稻瘟凈、乙硫苯威、除線磷、馬拉氧磷、甲基毒死蜱、四氟苯菊酯、甲基對硫磷、甲草胺、莠滅凈、撲草凈、甲萘威、對氧磷、噻唑膦、甲基嘧啶磷、特丁凈、噻蟲嗪、殺螟硫磷、二甲戊靈、馬拉硫磷、苯氟磺胺、異丙甲草胺、毒死蜱、甲基毒蟲畏、對硫磷、三唑酮、水胺硫磷、酞菌酯、嘧啶磷、三氯殺螨醇、多效唑、甲基異柳磷、氟啶脲、嘧菌環胺、氟蟲腈(含氟蟲腈硫醚、氟甲腈、氟蟲腈砜)、異柳磷、毒蟲畏、甲苯氟磺胺、滅蚜磷、烯丙菊酯、硫環磷、稻豐散、呋霜靈、喹硫磷、腐霉利、乙基溴硫磷、殺撲磷、殺蟲畏、丁草胺、苯硫威、甲醚菊酯、苯線磷、硫丹、硫丹硫酸鹽、敵草胺、殺螨酯、丙硫磷、丙溴磷、腈菌唑、滴滴涕、氟硅唑、氯唑磷、噻嗪酮、纈霉威、溴蟲腈、除草醚、烯唑醇、蟲螨磷、炔螨特、三唑磷、肟菌酯、惡霜靈、苯霜靈、三硫磷、苯腈磷、啶蟲脒、增效醚、芐呋菊酯、苯線磷亞砜、苯線磷砜、噠嗪硫磷、聯苯菊酯、胺菌酯、亞胺硫磷、苯氧威、溴螨酯、聯苯肼酯、甲氰菊酯、吡螨胺、苯醚菊酯、三氯殺螨砜、伏殺硫磷、溴苯磷、蚊蠅磷、氯氟氰菊酯、咪鮮胺、滅蟻靈、益棉磷、氯菊酯、蠅毒磷、噠螨靈、氯亞胺硫磷、乙氧苯甲胺、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、啶酰菌胺、氟氰戊菊酯、醚菊酯、氟硅菊酯、氟胺氰菊酯、氰戊菊酯、嘧菌酯、苯醚甲環唑、溴氰菊酯、唑蟲酰胺、烯酰嗎啉、滅蠅胺、烯啶蟲胺、涕滅威(含涕滅威砜、涕滅威亞砜)、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果、樂果、吡蚜酮、噻螨酮、噻蟲胺、吡蟲啉、蟲酰肼、除蟲脲、辛硫磷、唑螨酯、螺螨酯、氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟苯蟲酰胺、阿維菌素、甲維鹽、氟啶蟲酰胺、戊菌唑、甲基硫菌靈、呋蟲胺、乙基多殺菌素、溴氰蟲酰胺、乙螨唑、硫雙威、多殺菌素、魚藤酮、除蟲菊素、苦參堿、氟蟲脲、稻瘟靈、多菌靈、滅多威、異丙威、敵百蟲、莠去津、羥基莠去津、脫乙基莠去津、脫異丙基莠去津、丙環唑、吡嘧磺隆、芐嘧磺隆、苯磺隆、乙草胺、己唑醇、三環唑、氟環唑、羥基百菌清、滅幼脲、霜霉威、氯吡脲、抗倒酯、6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、矮壯素、烯效唑、甲哌啶、2,3,5-三碘苯甲酸、2,4-滴、對氯苯氧乙酸、赤霉素、二氯吡啶酸、吲哚乙酸、萘乙酸、脫落酸、丁酰肼。

2.3 前處理方法優化

通過對生產基地和農資店的調研發現，常見農業投入品包括農藥制劑和葉面肥等，制劑的常見類型有乳油(EC)、水分散粒劑(WG)、可濕性粉劑(WP)、水懸浮劑(SC)、水乳劑(EW)、水劑(AS)、微乳劑(ME)、種衣劑(FS)和熏蒸劑(VP)等。基于GC-MS/MS和LC-MS/MS篩查農藥隱性成分的方法類似于農產品中的農藥殘留檢測[6-13]，不同的是農產品中農藥殘留篩查通常在痕量級別(<0.01%)，而農業投入品中檢測通常在常量級別(>1%)，因而稀釋進樣是必要步驟。

稀釋濃度的確定。農藥制劑在使用時，通常需要先用水稀釋500～4 000倍，如果其中隱性成分的添加濃度太低，則制劑無法發揮增強藥效的作用，篩查添加的質量分數大于0.1%。結合農藥制劑登記有效成分含量通常在1%～90%的特點，以及歷年案例中添加的農藥隱性成分含量普遍在1%～10%的情況，本方法對隱性成分的濃度篩查范圍確定在0.1%～90%，重點篩查濃度確定為0.1%～10%。本研究前處理方法中配置農業投入品篩查母液濃度為10 g·L-1，按農藥有效成分濃度篩查范圍確定為10 ～9 000 mg·L-1，重點篩查濃度確定為10～1 000 mg·L-1。

根據實驗室三重四級桿質譜儀器的特性，確定GC-MS/MS中MRM模式的常規檢測線性范圍在10～500 μg·L-1，LC-MS/MS中MRM模式的常規檢測線性范圍在5～250 μg·L-1，當化合物檢測濃度過高時應通過稀釋獲得適宜的上機濃度。在目標物篩查過程中，GC-MS/MS中MRM模式檢測進樣濃度(母液稀釋100倍)應在100 ～9 000 μg·L-1，重點篩查濃度應在100～1 000 μg·L-1；LC-MS/MS中MRM檢測進樣濃度(再稀釋1 000倍)在10 ～900 μg·L-1，重點篩查濃度應在10～100 μg·L-1。這樣，農藥隱性成分目標物篩查方法的前處理能獲得合適的樣品檢測濃度。在無目標篩查過程中，GC-MS/MS中Scan(全掃描)模式檢測進樣濃度應在5～45 mg·L-1，也符合Thermo TSQ quantum GC全掃描模式下理想的檢測濃度。

凈化方法的確定。以往的農產品農藥殘留痕量分析方法，在凈化步驟確定時往往通過選取合適的凈化材料、做加標回收來驗證方法的可靠性。本研究針對農業投入品中農藥有效成分的檢測，將樣品稀釋1萬～10萬倍，稀釋后樣品中的雜質濃度已極低，可以滿足質譜檢測樣品的要求。同時由于隱性成分篩查目標成分不確定，如果選擇凈化方法，可能會導致某些隱性農藥成分與雜質一起被去除；因此，在隱性成分篩查方法中，仍以稀釋作為主要的樣品凈化手段。

2.4 GC-MS/MS和LC-MS/MS目標物精準篩查方法

以往對農業投入品的鑒定檢測，重點關注其有效成分含量是否與標注一致，因此選擇合適的氣相色譜或液相色譜等儀器即可滿足對標注農藥有效成分進行檢測的定量需要。色譜檢測器對農藥化合物具有很強的特異性[14]，如氣相色譜的電子俘獲檢測器(ECD)對有機氯和擬除蟲菊酯類農藥靈敏度高，氣相色譜的火焰光度檢測器(FPD)對有機磷農藥較靈敏。如果農藥在不匹配檢測器上進行分析，靈敏度可能很低甚至完全沒信號。因此，對于未標注的農藥隱性成分，色譜可能無法滿足檢測的需要。本檢測方法體系選用GC-MS/MS和LC-MS/MS等三重四級桿質譜進行檢測，適用于大多數農藥參數的篩查。同時，農產品農藥殘留分析中三重四級桿質譜的廣泛應用[15-17]，也為本隱性成分篩查方法提供了設備基礎。

GC-MS/MS檢測。基于GC-MS/MS的農藥多殘留方法，除具有更高的靈敏度、更低的噪音外，還可以通過縮短掃描范圍提高檢測效率，并能在同一方法中編輯更多的檢測參數。本研究中建立的GC-MS/MS檢測方法可同時分析149種化合物。具體步驟為：首先，確定一個農藥多殘留分析的升溫程序，需要保證所有待檢化合物都能出峰并且分布較為合理；其次，在確定的升溫程序條件下，確定每個化合物的保留時間，并獲得相應化合物的單離子檢測掃描(SRM)檢測的定量和定性離子對，包括母離子、子離子和碰撞能量，離子對的選定需要兼顧響應值和特異性；最后，以化合物出峰時間，編輯保留時間在左右各0.3 min的掃描范圍。

LC-MS/MS檢測。基于LC-MS/MS的農藥多殘留方法編輯時類似于GC-MS/MS，需要確定所有分析化合物的離子對信息、碰撞能量、去簇電壓，以及是ESI+還是ESI-源條件。

樣品定值時采用單點定值法，即通過上機樣品初檢獲得峰面積，通過逐級稀釋獲得和100 μg·L-1標樣相靠近的峰面積進行定值，再根據式(1)計算獲得隱性成分的添加濃度。

2.5 GC-MS/MS全掃描無目標篩查方法

農業投入品中添加的農藥隱性成分如屬于2.2節所給出的215種農藥，則GC-MS/MS和LC-MS/MS目標物篩查方法可有效確定化合物的成分和濃度。但如果隱性添加成分不在精準篩查農藥清單中，串聯氣譜與質譜的精準篩查方法則不能篩查出農藥隱性成分。如果該農藥隱性成分在GC-MS/MS全掃描條件下有響應，同時又收錄于標準化合物NIST數據庫中，則該隱性成分仍有較大可能被篩查發現。方法步驟如下：首先，通過無目標篩查方法獲得農業投入品中隱性成分的全掃描質譜圖，表1～2中149種農藥的全掃描圖譜如圖1所示。為扣除前處理和溶劑本底帶來的干擾，需要空白試劑經前處理后的本底質譜圖，扣除試劑空白，比對GC-MS/MS自帶的NIST數據庫，有較高匹配度的化合物可獲得初步判定，如果實驗室存有響應農藥隱性成分的標準品，可以通過標準品做進一步定性并定量。

圖1 149種農藥GC-MS/MS篩查方法的總離子流

2.6 方法應用

從浙江省內嘉善、諸暨、仙居、建德等地的農戶和農資店共采集90批次農業投入品，包括73批次農藥制劑和17批次肥料，其中，農藥制劑中篩查出20批次存在農藥隱性添加成分，17批次肥料中未檢出農藥隱性成分。

如表4所示，在農藥制劑中篩查出的農藥隱性成分包括蟲酰肼、阿維菌素、克百威、馬拉硫磷、氧樂果、三唑酮、氯蟲苯甲酰胺、滅幼脲、嘧菌酯、多菌靈、苯醚甲環唑、甲基硫菌靈、吡蟲啉、戊菌唑、聯苯菊酯、烯酰嗎啉、百菌清、腐霉利、異丙威。這些農藥隱性成分是否屬于人為添加，需要結合是否為代謝產物及添加目的再行判斷確認。

表4 農業投入品篩查樣品清單及檢出隱性成分情況

以在甲維鹽制劑中檢出阿維菌素為例，由于甲維鹽是通過生物農藥阿維菌素合成的，故而存在阿維菌素成分屬于正常現象，但濃度不應過大。從檢出的3批次含阿維菌素的甲維鹽制劑濃度判斷，應屬于非人為故意添加。再如，在苯醚甲環唑和醚菌酯復配殺菌劑中檢出0.1%的蟲酰肼，從功能上講，殺菌劑中添加殺蟲劑，兩者的目的不一致，且檢出濃度偏低(僅為0.1%)，推測可能是反應釜中的殘留成分，而非故意添加。其余檢出隱性成分或檢出濃度較高，或添加成分與標注信息的功能一致，故基本判定為檢出農藥隱性成分的農業投入品。

在篩查出農藥隱性成分的16批次農業投入品中：從隱性成分用途看，可分為殺蟲劑類農藥添加9批次和殺菌劑類農藥添加7批次；按農業投入品的生物或化學農藥分類，可分為2批次生物農藥和14批次化學農藥；按添加隱性成分是否屬于禁限用農藥，可分為2批次禁限用農藥，包括克百威和硫丹，以及14批次常規農藥。

3 小結

基于GC-MS/MS和LC-MS/MS建立的農業投入品中農藥隱性成分篩查方法體系，可用于篩查215種農藥的隱性添加及其他可在氣相色譜-質譜全掃描有響應且在NIST數據中被收錄的農藥。將該篩查方法體系應用于浙江省內抽檢的90批次農投品，共篩查出20批次樣品中含有未標注農藥隱性成分，其中4批次樣品判定為非故意添加，16批次樣品確定為含有增強藥效或增加功能的故意添加農藥隱性成分。農藥隱性成分篩查技術除用于農業投入品安全使用預警和規范農業投入品質量外，還可用于農作物除草劑藥害、因農業投入品使用而導致蠶大量死亡等農業生產糾紛或事故調查。農藥隱性成分篩查方法的應用難點在于農藥多殘留篩查參數的確定，以及相應混合標準品的獲得成本，未來需要政府部門引導，多個實驗室共同參與。