基于Ⅰ相代謝調控的葛根素微乳的制備及其藥動學研究Δ

代麗萍，李維，卓虹伊，劉貴容，賀艷，胡一晨，宋雨#，鄒亮，（1.成都大學四川抗菌素工業研究所，成都 61005；.成都大學醫學院，成都 610106；.成都中醫藥大學藥學院，成都 61117；.成都大學藥學與生物工程學院農業部雜糧加工重點實驗室，成都 610106）

葛根素（Puerarin）系從豆科植物野葛或甘葛干燥根中提取出的有效成分，其主要藥理作用為擴張冠狀動脈和腦血管、降低心肌耗氧量、改善微循環等，臨床廣泛應用于心腦血管疾病的治療[1-2]。葛根素水溶性差，口服后由于首關效應迅速被Ⅰ相代謝酶細胞色素P450（CYP）代謝[3-4]，導致葛根素以原型藥物入血的濃度較低，口服生物利用度降低，限制了其臨床應用。許多專家學者對提高葛根素的溶解度和口服生物利用度的方法進行了研究和探索，如進行結構修飾[5]、與其他藥物配伍合用[6]、制成磷脂復合物[7-8]、制成納米制劑[9]等。近年來的研究發現，自微乳釋藥系統（Self-emulsifying drug delivery system，SMEDDS）能夠提高藥物的溶解度并增加藥物溶出，提高藥物的生物利用度[10-11]。SMEDDS是由藥物、油相、乳化劑和助乳化劑組成的口服固體或液體制劑，其中部分輔料對CYP酶系具有一定的抑制作用，可提高原型藥物的入血濃度，從而提高藥物的生物利用度[12-13]。本研究結合前期預試驗以及參考相關研究[14]，選取具有抑制代謝酶活性的輔料，制備了具有Ⅰ相代謝調控作用（抑制CYP酶活性）的葛根素微乳（R-PR-ME），另外采用對Ⅰ相代謝無調控作用的輔料制備無Ⅰ相代謝調控作用的葛根素微乳（NR-PR-ME）；將R-PR-ME、NR-PR-ME和葛根素混懸液（PR-SP）分別灌胃大鼠，尾靜脈取血，采用高效液相色譜法（HPLC）測定血藥濃度，計算藥動學參數，比較生物利用度，為提高葛根素生物利用度的口服制劑的開發提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Angilent 1260 HPLC儀（美國安捷倫公司）；Zetasizer Nano ZSP納米粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）；ESJ120-4B電子天平（德國賽多利斯公司）；JN300-1氮吹儀（蘇州吉米諾儀器有限公司）；HC-2517高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州匯成科工貿有限公司）；Vortex Genius3漩渦混勻器（德國IKA公司）。

1.2 藥品與試劑

葛根素對照品（中國科學院成都生物研究所，批號：MUST-1611007，純度：99.71%）；葛根素原料藥（長沙中仁生物科技有限公司，批號：171101，純度：98%）；聚山梨酯20（西隴化工股份有限公司）；丙三醇、聚乙二醇400（PEG400）、聚山梨酯80、對羥基苯甲酸（批號：201409-1601，純度：＞99.0%）均購自成都市科隆化學品有限公司；油酸聚乙二醇甘油酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯均購自上海源葉生物技術有限公司；大豆油、聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremphor EL）均購自上海克拉瑪爾試劑公司；甲醇、乙腈（美國Sigma公司，色譜純）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，♂，體質量為（200±20）g，購自四川成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（川）2015-030。

2 方法與結果

2.1 油相、乳化劑和助乳化劑的選擇

根據文獻[14] 及前期預試驗結果發現，油酸聚乙二醇甘油酯、聚山梨酯20、Cremphor EL、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、PEG400對Ⅰ相代謝酶有抑制作用，于是選擇油酸聚乙二醇甘油酯作為油相，聚山梨酯20、Cremphor EL作為乳化劑，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、PEG400作為助乳化劑進行具有Ⅰ相代謝調控作用空白微乳處方的篩選和優化，共設計了4種處方，分別是（1）油相：油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑：聚山梨酯20，助乳化劑：辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，記為處方1；（2）油相：油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑：Cremphor EL，助乳化劑：辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，記為處方2；（3）油相：油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑：聚山梨酯20，助乳化劑：PEG400，記為處方3；（4）油相：油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑：Cremphor EL，助乳化劑：PEG400，記為處方4。同時選擇理化性質相似且無Ⅰ相代謝調控作用的輔料大豆油作為油相，聚山梨酯80作為乳化劑，甘油作為助乳化劑進行無Ⅰ相代謝調控作用的空白微乳處方的優化。

2.2R-PR-ME處方的確定

2.2.1 油相、乳化劑和助乳化劑的確定 采用Shah法制備空白微乳[15-16]。按“2.1”項下處方1、2、3、4的處方組成，照乳化劑和助乳化劑的質量比（Km）為1∶1、2∶1、3∶1的比例稱取相應質量的乳化劑和助乳化劑，置于10 mL離心管中渦旋混勻。按質量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9精密稱取1 g混合乳化劑和油相，磁力攪拌混合均勻，緩慢滴加去離子水，記錄使混合相剛剛澄清時水的質量以及形成微乳時各個組分的量。分別繪制Km為1∶1、2∶1、3∶1的偽三元相圖，篩選相圖中形成微乳面積最大的處方為最佳空白微乳處方，確定Km值，結果顯示，處方4不能形成澄清透明的制劑；處方1、2、3不同Km值的偽三元相圖分別見圖1、圖2、圖3。

圖1 處方1不同Km值的偽三元相圖Fig 1 Pseudo-ternary phase diagram of different Km values for formula 1

圖2 處方2不同Km值的偽三元相圖Fig 2 Pseudo-ternary phase diagram of different Km values for formula 2

比較圖1、2、3中微乳面積發現，圖1A中微乳面積最大，即最佳空白微乳處方為油相：油酸聚乙二醇甘油酯，乳化劑：聚山梨酯20，助乳化劑：辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯，Km：1∶1。且試驗發現，混合乳化劑-油相的質量比為5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9時不能形成澄清透明的制劑。

圖3 處方3不同Km值的偽三元相圖Fig 3 Pseudo-ternary phase diagram of different Km values for formula 3

2.2.2 混合乳化劑-油相質量比的確定 在空白微乳處方里加入過飽和的葛根素制成R-PR-ME，3 000 r/min離心10 min，取上清液用甲醇稀釋后于液相檢測，測得葛根素的量[16]，計算所制R-PR-ME的最大載藥量（DL＝M1/M2，其中M1為葛根素質量，M2為R-PR-ME質量）。結果顯示，當混合乳化劑-油相質量比為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4時所制R-PR-ME的最大載藥量分別為50.57、67.50、40.45、43.11 mg/g，確定混合乳化劑-油相的最佳質量比為8∶2。

綜上，確定R-PR-ME的處方為油酸聚乙二醇甘油酯（油相）-聚山梨酯20（乳化劑）-辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（助乳化劑）的質量比：2∶4∶4，載藥量為67.50 mg/g。

2.3NR-PR-ME處方的確定

以大豆油為油相，聚山梨酯80為乳化劑，甘油為助乳化劑，按“2.2.1”項下方法進行偽三元相圖考察。結果發現，只有當Km為1∶1且混合乳化劑-油相質量比為9∶1時才能形成澄清透明的微乳制劑。由此確定，NR-PR-ME處方為大豆油（油相）-聚山梨酯80（乳化劑）-甘油（助乳化劑）的質量比：1∶4.5∶4.5。在該空白微乳中加入葛根素制成NR-PR-ME，測定其最大載藥量為61.32 mg/g。

2.4R-PR-ME和NR-PR-ME的表征

采用納米粒度儀測定R-PR-ME和NR-PR-ME的粒徑和多分散系數（PDI）。結果顯示，R-PR-ME的平均粒徑為（22.59±0.53）nm、PDI為 0.182±0.017（n＝3）；NR-PR-ME的平均粒徑為（15.45±1.06）nm、PDI為0.156±0.012（n＝3）。R-PR-ME和NR-PR-ME的粒徑分布圖見圖4。

圖4R-PR-ME和NR-PR-ME的粒徑分布圖Fig 4 Particle size distribution of R-PR-ME and NRPR-ME

2.5 生物樣品中葛根素的含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Global Chromatography C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水（15∶85，V/V）；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測波長：250 nm；進樣量：10 μL。

2.5.2 溶液的制備 ①對照品溶液：精密稱取葛根素對照品5.10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得質量濃度為510.00μg/mL的對照品貯備液，再用甲醇稀釋，制成質量濃度分別為0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.55μg/mL系列對照品溶液。②內標溶液：精密稱取對羥基苯甲酸10.00 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得質量濃度為400.00μg/mL的內標貯備液，臨用前用甲醇稀釋成20.00μg/mL的內標溶液。

2.5.3 血漿樣品的處理 冷凍血漿在室溫下融化，渦旋混勻，取血漿0.1 mL于離心管中，加入10 μL內標溶液，再加入0.4 mL的甲醇用以沉淀蛋白，渦旋振蕩2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，40℃氮氣吹干，殘渣中加入0.1 mL甲醇復溶，渦旋振蕩5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液10 μL進樣分析。

2.5.4 方法專屬性 分別用大鼠空白血漿、大鼠空白血漿+葛根素對照品+內標、灌胃后10 min的大鼠含藥血漿，按“2.5.3”項下方法處理后，進樣測定。結果顯示，葛根素和內標的保留時間分別是8.040 min和10.107 min，峰形對稱，內源性雜質不干擾待測物質的分離，理論板數以葛根素峰計不低于5 000，色譜圖見圖5。

2.5.5 線性關系、檢測限與定量下限 取100 μL大鼠空白血漿，置于1.5 mL離心管中，分別加入系列葛根素對照品溶液，使血漿中葛根素的質量濃度分別為0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.55 μg/mL，再按照“2.5.3”項下方法處理后，進樣測定，以葛根素與內標的峰面積比為縱坐標（y），葛根素質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸分析。另以信噪比為3∶1時對應的葛根素質量濃度為檢測限，回歸方程線性范圍最低點為定量下限。結果顯示，回歸方程為y＝0.285 5x+0.007 8（r＝0.998），葛根素檢測質量濃度的線性范圍為0.08～2.55μg/mL，檢測限為0.02μg/mL，定量下限為0.08μg/mL。

圖5 高效液相色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms

2.5.6 準確度 按“2.5.5”項下方法制備質量濃度分別為 0.16、0.64、1.92 μg/mL的質控樣品，各 5份，按照“2.5.3”項下方法處理后，進樣測定，代入回歸方程計算實測濃度，以實測濃度與加入濃度之比計算準確度。結果顯示，低、中、高質量濃度質控樣品的準確度分別為97.26%、97.13%、99.82%，RSD分別為1.48%、1.32%、1.28%（n＝5）。

2.5.7 提取回收率 按“2.5.5”項下方法制備質量濃度分別為0.16、0.64、1.92 μg/mL的質控樣品，各5份，按照“2.5.3”項下方法處理后，進樣測定，記錄峰面積為A1；同時以相應濃度的對照品溶液未經提取直接進樣測定，記錄峰面積為A2，以A1/A2計算提取回收率。結果顯示，低、中、高質量濃度質控樣品的提取回收率分別為72.14%、75.20%、78.63%，RSD分別為2.45%、2.03%、2.16%（n＝5），表明該方法的提取回收率良好。

2.5.8 精密度 按“2.5.5”項下方法制備質量濃度分別為 0.16、0.64、1.92 μg/mL的質控樣品，各 5份，按照“2.5.3”項下方法處理后，每日測定1次和連續測定3 d，考察日內、日間精密度。結果顯示，低、中、高質量濃度質控樣品的日內RSD分別為3.68%、3.54%、2.09%（n＝5），日間RSD分別為5.17%、4.39%、4.18%（n＝3），均符合生物樣本分析方法的要求。

2.5.9 穩定性 按“2.5.5”項下方法制備質量濃度分別為 0.16、0.64、1.92 μg/mL的質控樣品，各 4份，按照“2.5.3”項下方法處理后，分別室溫放置6 h、自動進樣器內放置24 h、凍融循環3次、－20℃冷凍7 d，考察不同存儲條件下的穩定性。結果顯示，質控樣品室溫放置6 h葛根素的RSD均＜10%（n＝3），自動進樣器內放置24 h葛根素的RSD均＜7.0%（n＝3），凍融循環3次葛根素的RSD均＜10%（n＝3），－20℃冷凍7 d葛根素的RSD均＜15%（n＝3），表明生物樣本穩定性良好。

2.6 藥動學實驗

分別將R-PR-ME、NR-PR-ME、PR-SP制備成含葛根素12 mg/mL的生理鹽水溶液。取SD大鼠18只，將大鼠隨機分為R-PR-ME組、NR-PR-ME組和PR-SP組，每組6只，禁食不禁水12 h，分別灌胃相應藥物，根據制劑的最大溶解度和大鼠的最大給藥體積確定給藥劑量為120 mg/kg（以葛根素計）。分別在給藥前（空白）以及給藥后5、10、15、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480、600 min尾靜脈取血0.3 mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，4 000 r/min離心10 min，取上層血漿，－20℃保存備用。取血漿樣品，按照“2.5.3”項下方法處理后，進樣測定，代入回歸方程計算葛根素的濃度，繪制藥-時曲線；采用DAS 2.0軟件進行處理，計算藥動學參數；采用SPSS 19.0軟件對數據進行t檢驗。大鼠體內葛根素的平均藥-時曲線見圖6，藥動學參數見表1。

圖6 大鼠體內葛根素的平均藥-時曲線Fig 6 Average blood concentration-time curves of puerarin in rats

表1 灌胃給藥后葛根素在大鼠血漿中的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of puerarin in rat plasma after intragastric administration（x±s，n＝6）

表1 灌胃給藥后葛根素在大鼠血漿中的藥動學參數（±s，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of puerarin in rat plasma after intragastric administration（x±s，n＝6）

注：與PR-SP組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與NR-PR-ME組比較，#P＜0.05Note：vs.PR-SP group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.NR-PR-ME group，#P＜0.05

參數cmax，μg/mL tmax，min AUC0-600 min，μg·min/mL AUC0-∞，μg·min/mL CL/F，mL/（min·kg）t1/2β，min MRT，min R-PR-ME組1.316±0.306＊11.667±2.357＊134.187±37.152＊#187.361±43.208＊#0.625±0.158＊365.880±101.250＊＊#155.068±33.204＊#PR-SP組0.425±0.106 21.660±4.082 49.623±12.143 75.217±16.565 2.127±0.248 80.063±21.189 60.524±14.086 NR-PR-ME組1.082±0.294＊10.833±1.863＊65.145±18.762 131.675±32.017＊1.084±0.324＊283.280±80.940＊100.264±27.683＊

由圖6顯示，葛根素在大鼠體內的藥動學屬于二室模型。由表1結果顯示，與PR-SP組比較，R-PR-ME組和NR-PR-ME組大鼠體內的葛根素的cmax、AUC、t1/2β、平均滯留時間（MRT）明顯增加，tmax明顯縮短，消除率（CL/F）明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。以PR-SP為參比制劑，R-PR-ME的相對生物利用度為270.41%，NR-PR-ME的相對生物利用度為131.28%。R-PR-ME組大鼠體內的葛根素的AUC、t1/2β和MRT均明顯高于NR-PR-ME組（P＜0.05），以NR-PR-ME為參比制劑，R-PR-ME的相對生物利用度為205.98%。

3 討論

CYP酶系在肝臟及腸道含量豐富，參與眾多藥物的Ⅰ相代謝，明顯降低了CYP底物藥物的口服生物利用度。本文從代謝調控著手，以葛根素為研究對象，采用對CYP酶系活性有抑制作用的輔料制備了具有Ⅰ代謝調控作用的微乳來提高藥物的口服生物利用度，并采用偽三元相圖和以載藥量為指標對處方進行優化。本研究結果顯示，成功制得R-PR-ME，且其載藥量高、穩定性好、粒徑小且分布均勻，同時本文采用大鼠模型比較了R-PR-ME、NR-PR-ME、PR-SP的藥動學特征，由藥動學結果可知，與PR-SP比較，R-PR-ME和NR-PR-ME的AUC、cmax、t1/2β和MRT均明顯增加，CL/F明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。以NR-PR-ME為參比制劑，R-PR-ME相對生物利用度為205.98%，由此說明R-PR-ME中的輔料油酸聚乙二醇甘油酯、聚山梨酯20、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯可能通過抑制肝腸代謝酶CYP的活性，減少了葛根素在體內被CYP酶系的代謝，增加了葛根素的口服生物利用度，表明本文基于代謝調控增加葛根素口服生物利用度的思路可行。另外本文制備的NR-PR-ME相對于PR-SP也提高了葛根素的口服生物利用度，且在體內快速達到峰值，其原因可能是自微乳系統通過增加葛根素的溶解性、穩定性以及淋巴循環，促進了葛根素的胃腸道吸收，從R-PR-ME組、NR-PR-ME組的MRT均延長可以看出自微乳釋藥系統具有緩釋作用，這與前人的研究結果一致[17]，也表明了本文制備自微乳釋藥系統的工藝可靠。至于R-PR-ME對轉運蛋白、細胞膜通透性、細胞攝取、細胞毒性等方面的影響有待進一步研究。

綜上，本文從代謝調控出發，制備了具有Ⅰ代謝調控作用的葛根素微乳并研究其大鼠體內藥動學，為提高葛根素口服生物利用度和葛根素的劑型開發提供了參考。