參芍益氣養(yǎng)血顆粒對小鼠實驗性再生障礙性貧血的改善作用及骨髓抑制的防治作用研究Δ

姚東風(fēng)，許夢榮，馬麗，鄧穎穎，張恩戶（陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室/陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點研究室，陜西咸陽 712046）

再生障礙性貧血（Aplastic anemia，AA）約占血液系統(tǒng)疾病的12.6%，是一種常見的血液系統(tǒng)疾病，該疾病因復(fù)雜、病程長，治療較困難，其主要特征為骨髓造血功能障礙和外周血象[諸如紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、血小板（PLT）數(shù)目和血紅蛋白（HGB）含量] 減少以及貧血、感染和出血的發(fā)生[1-2]。骨髓抑制作為一種常見的骨髓造血功能異常的病癥，其主要特征為外周血中WBC、PLT數(shù)目急劇減少，進(jìn)而導(dǎo)致骨髓造血功能異常[3]。參芍益氣養(yǎng)血顆粒由陜西省血液病防治研究所附屬醫(yī)院研發(fā)制成，由紅參、白芍、黃芪、熟地黃、當(dāng)歸、淫羊藿、巴戟天、續(xù)斷、菟絲子、仙鶴草、白術(shù)（炒）、砂仁等十二味藥組成，具有益氣生津、養(yǎng)血斂陰、益精填髓等功效，用于治療AA及放、化療所致的外周血白細(xì)胞減少癥。針對此中成藥制劑，一直以來只有較少的療效觀察和臨床試驗，尚未通過現(xiàn)代藥效學(xué)實驗對AA及骨髓抑制的防治作用進(jìn)行驗證。鑒于此，本課題組擬通過建立AA小鼠模型以及骨髓抑制小鼠模型，用以評估參芍益氣養(yǎng)血顆粒對AA的改善作用以及對骨髓抑制的防治作用，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BT224S電子天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；60Co放射源（空軍軍醫(yī)大學(xué)鈷源室）；BC-5300Vet全自動血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；FT-200動物跑步機(jī)（成都泰盟軟件有限公司）；E100倒置光學(xué)顯微鏡[日本尼康映像儀器銷售（中國）有限公司] 。

1.2 藥品與試劑

參芍益氣養(yǎng)血顆粒（陜西省血液病防治研究所附屬醫(yī)院提供，由陜西郝其軍制藥股份有限公司委托生產(chǎn)，批號：20171001，規(guī)格：每g顆粒含生藥2.52 g）；益血生膠囊（吉林三九金復(fù)康藥業(yè)有限公司，批號：170806，規(guī)格：0.25 g）；注射用環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號：17110425，規(guī)格：0.2 g）；注射用5-氟尿嘧啶（5-FU，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：FA170603，規(guī)格：10 mL∶0.25 g）；磷酸鹽緩沖液（PBS，西安赫特生物有限公司）；枸櫞酸鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；煌焦油藍(lán)染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 動物

BALB/c小鼠72只，♂，SPF級，6周齡，體質(zhì)量25～30 g；KM小鼠90只，♂，SPF級，8周齡，體質(zhì)量18～22 g。以上小鼠均由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（軍）2012-0007。

2 方法

2.1 參芍益氣養(yǎng)血顆粒對60Co-γ射線聯(lián)合CTX致AA模型小鼠的改善作用

2.1.1 造模、分組與給藥 取BALB/c小鼠72只，隨機(jī)取12只為空白組，剩余60只小鼠為造模組。空白組小鼠不作其他處理，給予常規(guī)飲食；造模組小鼠置于3.0 Gy60Co-γ射線下，以劑量率1.353 1 Gy/min、距離 70 cm照射4 min 51 s[4]，并于照射后第4、5、6天分別腹腔注射CTX 40 mg/kg，復(fù)制AA模型。注射完CTX后，隔天各取5只空白組和造模組小鼠眼球取血進(jìn)行RBC、WBC、HGB、PLT檢測，若造模組小鼠外周血象指標(biāo)較空白組顯著降低，則證實AA模型成立[5]。將60只造模成功的AA模型小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、陽性對照組（益血生膠囊，以內(nèi)容物計為0.625 g/kg，為人臨床劑量的等效劑量）和參芍益氣養(yǎng)血顆粒低、中、高劑量組（以生藥量計分別為1.26、7.56、15.12 g/kg，分別相當(dāng)于人臨床劑量的1、6、12倍），每組12只。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，空白組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃7 d。

2.1.2 一般體征觀察 給藥期間每天觀察各組小鼠的精神活動、毛發(fā)狀況、飲食、二便等一般體征。

2.1.3 力竭實驗觀察 末次給藥前1天（即給藥第6天），將各組小鼠逐只置于動物跑步機(jī)上，在轉(zhuǎn)速為35 r/min下跑步直至力竭，記錄小鼠力竭距離和力竭時間。

2.1.4 外周血象檢測及網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比（Ret）測定

末次給藥后1 h，眼球取血，采用全自動血液細(xì)胞分析儀檢測外周血象（RBC、WBC、PLT數(shù)目和HGB含量）；同時取血1滴置于1.5 mL離心管中，加入1滴煌焦油藍(lán)染色液，搖勻，靜置15 min后，吸取10 μL于載玻片上，推片，顯微鏡下進(jìn)行Ret計數(shù)。

2.1.5 骨髓有核細(xì)胞（BMNC）數(shù)目檢測 取血后處死小鼠，分離股骨，暴露兩端骨髓，用骨髓緩沖液（3.8%枸櫞酸鈉∶PBS＝1∶9）1 mL反復(fù)沖洗骨髓腔，得骨髓懸液。取骨髓懸液1小滴于細(xì)胞計數(shù)板上，在倒置顯微鏡下直接讀取各視野內(nèi)的BMNC數(shù)目。

2.2 參芍益氣養(yǎng)血顆粒對5-FU致小鼠骨髓抑制的防治作用

取90只KM小鼠按“2.1.1”項下方法分組、給藥，每組15只，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃12 d。給藥3 d后，除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射5-FU（125 mg/kg）1次；之后隔天腹腔注射5-FU（62.5 mg/kg）1次，共2次。腹腔注射3次5-FU后，取血檢測外周血象及BMNC數(shù)目，若變化與骨髓抑制模型相符，證實模型成立[6]。末次給藥12 h后，按“2.1.4”項下方法進(jìn)行外周血象（RBC、WBC、PLT數(shù)目和HGB含量）檢測和Ret測定以及BMNC數(shù)目檢測。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 參芍益氣養(yǎng)血顆粒對60Co-γ射線聯(lián)合CTX致AA模型小鼠的改善作用

3.1.1 小鼠一般體征觀察結(jié)果 空白組小鼠活動、飲食及二便均正常。與空白組比較，模型組小鼠活動、飲食明顯減少，精神狀態(tài)不佳，大便稀薄，皮毛豎起，體型消瘦，體質(zhì)量減輕，耳、唇、甲部蒼白，呈貧血貌。與模型組比較，陽性對照組和參芍益氣養(yǎng)血顆粒中、高劑量組小鼠一般體征均有不同程度改善，小鼠活動增強(qiáng)，飲食、二便恢復(fù)正常；而參芍益氣養(yǎng)血顆粒低劑量組小鼠一般體征與模型組無異。由于化療藥物CTX存在很嚴(yán)重的毒副作用，小鼠骨髓功能受到抑制時，其他功能也遭到損害，因此有部分小鼠死亡。其中，模型組有4只小鼠死亡，陽性對照組有1只小鼠死亡，參芍益氣養(yǎng)血顆粒低、中、高劑量組分別有3、3、2只小鼠死亡。

3.1.2 力竭實驗結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠力竭距離和力竭時間均顯著縮短（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對照組和參芍益氣養(yǎng)血顆粒中、高劑量組小鼠力竭距離和力竭時間均顯著延長（P＜0.05或P＜0.01）。各組小鼠跑步力竭距離和力竭時間測定結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠跑步力竭距離和力竭時間測定結(jié)果（x±s）Tab 1 Determination results of exhaustion distance and exhaustion time of mice in each group（x±s）

3.1.3 小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目測定結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠外周血象（WBC、RBC、PLT數(shù)目和HGB含量）以及Ret、BMNC數(shù)目顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），說明模型組小鼠呈現(xiàn)出骨髓造血系統(tǒng)抑制現(xiàn)象；與模型組比較，陽性對照組和參芍益氣養(yǎng)血顆粒高劑量組小鼠外周血象（WBC、RBC、PLT數(shù)目和HGB含量）以及Ret、BMNC數(shù)目以及參芍益氣養(yǎng)血顆粒中劑量組小鼠Ret均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組AA模型小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目的測定結(jié)果見表2。

表2 各組AA模型小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目的測定結(jié)果（x±s）Tab 2 Determination results of peripheral hemogram，Ret and BMNC number of AA model mice in each group（x±s）

3.2 參芍益氣養(yǎng)血顆粒對5-FU致骨髓抑制模型小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目的影響

與空白組比較，模型組小鼠外周血象（WBC、RBC、PLT數(shù)目）、Ret和BMNC數(shù)目顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），但外周血象HGB含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），呈現(xiàn)出急性骨髓抑制的特征，與骨髓抑制的臨床特征一致；與模型組比較，陽性對照組和參芍益氣養(yǎng)血顆粒高劑量組小鼠外周血象（WBC、RBC、PLT數(shù)目）、Ret和BMNC數(shù)目以及參芍益氣養(yǎng)血顆粒中劑量組小鼠外周血RBC數(shù)目、Ret和BMNC數(shù)目均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組骨髓抑制模型小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目的測定結(jié)果見表3（注：由于化療藥物5-FU對小鼠具有一定的肝腎損傷，部分小鼠死亡，導(dǎo)致除空白組外其余各組小鼠的只數(shù)均有減少）。

表3 各組骨髓抑制模型小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目的測定結(jié)果（x±s）Tab 3 Determination results of peripheral hemogram，Ret and BMNC number of myelosuppression model mice in each group（x±s）

4 討論

AA作為一種常見的血液系統(tǒng)疾病，其主要特征為以骨髓造血功能衰減，導(dǎo)致骨髓有核細(xì)胞增生低下、全血細(xì)胞減少，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染等病癥[7-9]。目前，對此常用骨髓移植的療法和免疫抑制治療，但骨髓移植費用高，且骨髓難以匹配[10]；而免疫抑制治療死亡率高，易引發(fā)多種惡性疾病[11]。骨髓抑制作為腫瘤放、化療后最常見的一種毒性反應(yīng)[6]，其致病機(jī)制為化療藥物進(jìn)入體內(nèi)引起造血祖細(xì)胞（HPC）大量減少，而且會誘導(dǎo)干細(xì)胞的凋亡[12-14]，破壞骨髓基質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致骨髓造血功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致外周血象下降、Ret減少[4，15]。益血生膠囊作為一種已上市的中成藥制劑，主要用于治療脾腎兩虛、精血不足引起的AA及骨髓抑制等癥，對其具有良好的預(yù)防及治療作用[16]，因此在本研究中將其作為陽性對照藥觀察對比參芍益氣養(yǎng)血顆粒的療效。

參芍益氣養(yǎng)血顆粒以益氣養(yǎng)血藥物為主，依據(jù)中醫(yī)經(jīng)典配方理論[17]，方中紅參、白芍為君藥，紅參可益氣、養(yǎng)陰、生津，白芍則可養(yǎng)血、斂陰，兩藥同用，有益氣生津之功；黃芪可益氣、養(yǎng)血，當(dāng)歸、熟地黃、仙鶴草可補血活血、止血，四藥共用可增強(qiáng)益氣養(yǎng)血之效，在方中共為臣藥；淫羊藿、巴戟天、菟絲子、續(xù)斷，四藥共用有健髓生血、壯陽補腎之功，在方中亦為臣藥；炒白術(shù)可健脾益氣，砂仁可化濕行氣，二藥同用可補脾健胃，使脾胃運化功能得以正常運行，而脾胃為后天生化之源，因此二藥配伍應(yīng)用有利于氣血之恢復(fù)，在方中共為佐藥。總之，方中諸藥，配伍精當(dāng)，共奏益氣生津、健髓生血、壯陽補腎、補脾健胃之功效，從而達(dá)到治療AA、骨髓增生異常綜合征、血小板減少癥及放化療致血細(xì)胞減少癥的目的[18] 。

目前AA模型的建立方法有多種，本課題組依據(jù)郭雨晨等[19]報道的AA模型建立方法，成功復(fù)制了AA模型。灌胃給藥后，發(fā)現(xiàn)小鼠在體征方面以及飲食、二便方面均恢復(fù)正常，并且可促進(jìn)AA模型小鼠外周血象WBC、RBC、PLT數(shù)目及HGB含量的恢復(fù)，以及Ret和BMNC數(shù)目的增加，表明骨髓造血功能得到了恢復(fù)，證實了參芍益氣養(yǎng)血顆粒有改善小鼠AA骨髓造血功能的作用。另外，本課題組參考了曹瑞等[20]的建模方法，成功復(fù)制了骨髓抑制小鼠模型。本課題組在建立骨髓抑制模型時采用造模與給藥同時進(jìn)行，主要為了避免單獨注射5-FU導(dǎo)致小鼠肝、腎毒性而大量死亡（課題組前期采用單獨注射5-FU，結(jié)果小鼠全部死亡）。本研究結(jié)果顯示，參芍益氣養(yǎng)血顆粒給藥后小鼠外周血象WBC、RBC、PLT數(shù)目增加，Ret增多，提示骨髓紅細(xì)胞的生成功能得到恢復(fù)[21]；BMNC數(shù)目顯著增加，提示骨髓造血功能恢復(fù)。以上結(jié)果提示，參芍益氣養(yǎng)血顆粒具有改善骨髓抑制模型小鼠骨髓造血功能的作用。

綜上所述，參芍益氣養(yǎng)血顆粒對小鼠AA和骨髓抑制具有一定的改善和防治作用，可使2種模型小鼠的骨髓造血功能逐漸恢復(fù)，其作用機(jī)制可能與改善造血微環(huán)境、恢復(fù)造血干細(xì)胞功能有關(guān)，然而對于藥物靶點作用機(jī)制和相關(guān)通路仍需進(jìn)一步探究。