飛燕草素通過Wnt/β-catenin信號通路抑制乳腺癌的機制研究

蔣婷婷，白金玉，任青蔓，李金原，彭曉莉，韓 彬

成都醫學院公共衛生學院，成都 610000

乳腺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，位于女性腫瘤發病率第一位，嚴重威脅女性的身心健康[1]。目前認為蔬菜水果中所含的植物化合物，尤其是多酚類植物化合物可能是其預防控制腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)發生發展的主要活性成分。花青素，屬黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、防治腫瘤和心血管疾病等多種生物學活性[2,3]。課題組前期研究發現，黑米花青素能夠抑制裸鼠乳腺癌異種移植瘤生長[4]，飛燕草素是花青素中常見的一種單體，在花青素中豐度較高，生物學活性也較強[5]。研究發現，飛燕草素能抑制腫瘤細胞增殖，血管生成和侵襲轉移，誘導腫瘤細胞凋亡[6,7]，但機制仍不清楚。

Wnt/β-catenin信號通路是在生物體進化過程中高度保守的信號轉導途徑。研究發現Wnt/β-catenin信號通路在細胞增殖、分化和凋亡等過程中發揮重要作用，該信號通路的異常與細胞惡性生長和癌變密切相關[8]。抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，可以阻止上皮間質轉化，進而抑制乳腺癌轉移[9]。本研究通過飛燕草素干預乳腺癌移植瘤和乳腺癌MDA-MB-231細胞，探討飛燕草素是否通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，發揮抗乳腺癌的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

飛燕草素(純度98%)購自美國Sigma公司；飛燕草素(純度25%)購自大興安嶺林格貝寒帶生物科技股份有限公司；人乳腺癌細胞MDA-MB-231購自中國科學院上海細胞庫；細胞培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自德國Gibco公司；抗體購自美國Millipore公司。

1.2 主要儀器

主要使用儀器包括美國Thermo公司的臺式高速冷凍離心機和ND-2000微量紫外可見光分光光度計；日本Olympus公司的IX71型倒置熒光相差顯微鏡；美國Bio-Rad公司的ChemiDoc XRS化學發光成像儀。

1.3 細胞培養

MDA-MB-231細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，培養液為含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，常規方法進行傳代，選對數生長期細胞實驗。

1.4 飛燕草素干預乳腺癌裸鼠移植瘤

12只6周齡雌性 BALB/c nude 裸鼠購于四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗動物研究所(SYXK(川)2018-058)。重量15～20 g，飼養于相對濕度40%～60%，溫度23～25 ℃的SPF級動物實驗室。裸鼠適應性喂養3天后，隨機分為對照組(灌胃滅菌水)和飛燕草素干預組，每組6只。裸鼠右側腋窩處注射細胞濃度4×106/0.2 mL的乳腺癌MDA-MB-231細胞，每隔3天用游標卡尺測量移植瘤的最大直徑和最小直徑，按V=0.52×D2×L公式計算腫瘤體積。飛燕草素干預組從接種日開始，用飛燕草素(100 mg/kg/天)灌胃，持續28天。實驗結束后，處死動物，取下腫瘤，切下約1 cm×1 cm組織塊，多聚甲醛浸泡約1周后，進行包埋和切片。

1.5 免疫組化染色

對組織切片進行免疫組化染色，辣根過氧化物酶顯色試劑盒進行顯色處理，用PBS緩沖液作為陰性對照，免疫組化染色后以細胞核呈中等強度棕黃色判定為陽性細胞，在低倍鏡下(×10)瀏覽整張切片選擇熱點區域，用高倍(×40)對陽性細胞進行計數，結果表示為陽性細胞在整張切片中同類型細胞中的百分比。

1.6 數據統計學處理方法

2 實驗結果

2.1 飛燕草素對乳腺癌MDA-MB-231細胞Wnt/β-catenin通路的影響

通過Western blot檢測乳腺癌MDA-MB-231細胞Wnt/β-catenin信號通路β-catenin和GSK-3β蛋白表達水平。由圖2可見，飛燕草素作用MDA-MB-231細胞，能明顯降低細胞β-catenin和p-GSK-3β的蛋白表達水平。

圖1 飛燕草素的化學結構式Fig.1 Chemical structure of delphinidin

圖2 飛燕草素對乳腺癌MDA-MB-231細胞 Wnt/β-catenin通路的影響Fig.2 The effect of delphinidin on Wnt/β-catenin signaling pathway in breast cancer cells MDA-MB-231

2.2 飛燕草素對乳腺癌MDA-MB-231細胞Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白表達的影響

通過Western blot檢測乳腺癌MDA-MB-231細胞Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白表達的影響。由圖3可見，飛燕草素作用MDA-MB-231細胞，能明顯降低細c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白表達水平。

圖3 飛燕草素對乳腺癌MDA-MB-231細胞 Wnt/β-catenin信號通路 c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白表達的影響Fig.3 The effect of delphinidin on c-myc,cyclin D1and MMP-7 in breast cancer cells MDA-MB-231

2.3 飛燕草素對裸鼠異種移植瘤體積的影響

飛燕草素干預裸鼠后，與對照組(灌胃滅菌水)相比，飛燕草素能夠降低裸鼠異種移植瘤體積，且差異具有統計學意義(P< 0.05)。

圖4 飛燕草素對裸鼠異種移植瘤體積的影響Fig.4 Effect of delphinidin on growth xenograft tumor of node mice注：與對照組比較，#P < 0.05。Note:Compare with control,#P < 0.05.

2.4 飛燕草素對裸鼠異種移植瘤Wnt/β-catenin通路的影響

Western blot檢測裸鼠MDA-MB-231細胞異種移植瘤組織Wnt/β-catenin信號通路β-聯蛋白(β-catenin)和GSK-3β蛋白表達水平。由圖5可見，與對照組(灌胃滅菌水))相比，飛燕草素能降低裸鼠腫瘤組織中β-catenin和p-GSK-3β的蛋白表達水平。

2.5 飛燕草素對裸鼠移植瘤和肺轉移瘤Ki-67及乳腺腫瘤MMP-7表達的影響

免疫組化檢測腫瘤組織MMP-7的表達水平，由圖6可見，飛燕草素干預組腫瘤組織MMP-7表達明顯低于對照組，差異有統計學意義(P< 0.01)。

圖5 飛燕草素對裸鼠移植瘤Wnt/β-catenin通路的影響Fig.5 Effect of delphinidin on Wnt/β-catenin signaling pathway in xenografted tumor

Ki-67蛋白是檢測細胞增殖的重要指標，與乳腺癌的發生發展及預后有關[10]。我們檢測了Ki-67在腫瘤組織中的表達，結果表明對照組和飛燕草素干預組的腫瘤組織中Ki-67有陽性表達(圖6)，陽性細胞數百分比分別為82%和57.8%，飛燕草素干預組腫瘤組織Ki-67表達明顯低于對照組，差異有統計學意義(P< 0.01)；Ki-67在祼鼠對照組和飛燕草素干預組的肺組織轉移瘤中有陽性表達(圖6)，陽性細胞數百分比分別為64.4%和36%，飛燕草素干預組肺組織轉移瘤Ki-67表達明顯低于對照組，差異有統計學意義(P< 0.01)。

3 討論

Ki-67是增殖細胞表達的核抗原，在乳腺癌、肺癌等腫瘤組織中高表達，是反映腫瘤細胞增殖活性的可靠指標[11]。本實驗研究發現飛燕草素能顯著抑制裸鼠乳腺癌腫瘤組織和肺組織轉移瘤Ki-67表達，表明飛燕草素具有抑制腫瘤組織細胞增殖的作用。

Wnt/β-catenin信號通路在細胞的增殖及分化過程中起到重要作用。該信號通路中任何一個信號分子異常都會導致β-catenin在胞質和胞核內聚集，促使通路下游的靶基因轉錄活性增高，導致細胞異常增殖[12]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵分子，其異常表達是乳腺癌發生過程中的早期分子事件，與乳腺癌轉移和預后不良相關[13]。GSK-3是在進化中非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其普遍存在于真核細胞，GSK-3磷酸化后，調節細胞分化、增殖以及凋亡等。 GSK-3β磷酸化后，可避免β-catenin被GSK-3β磷酸化，使β-catenin在細胞質中逐漸堆積，活化Wnt/β-catenin信號通路。GSK-3β在調節細胞分化、增殖以及凋亡中發揮重要作用[14]。

Wnt/β-catenin信號通路活化后促進β-catenin入核激活下游靶基因轉錄，調控細胞周期、分化、生長和遷移[15]。Wnt/β-catenin下游靶基因眾多，如細胞周期相關蛋白cyclinD1、原癌基因 c-myc和MMP-7。研究發現cyclinD1、c-myc和MMP-7在乳腺癌中過表達[16]。Cyclin D1高表達可促進乳腺癌侵襲和轉移[17]。c-myc可促進細胞過度增殖，抑制細胞凋亡，進而促進腫瘤的發生發展[18]。降低MMP-7的表達水平可減慢腫瘤生長，降低腫瘤細胞侵襲能力[19]。

本研究發現飛燕草素能明顯降低乳腺癌MDA-MB-231細胞β-catenin和p-GSK-3β的蛋白表達水平，能顯著降低Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白的表達。飛燕草素還能降低乳腺腫瘤組織中MMP-7的表達水平。實驗結果提示飛燕草素具有抑制Wnt/β-catenin信號通路的作用。

圖6 飛燕草素對裸鼠移植瘤和肺轉移瘤Ki-67及乳腺腫瘤MMP-7表達的影響(×400)Fig.6 Effect of delphinidin on Ki-67 or MMP-7 expression in xenografted tumor and pulmonary metastatictumor (×400)注：與對照組比較，##P < 0.01。Note:Compare with control,##P < 0.01.

綜上所述，本研究結果表明飛燕草素通過Wnt/β-catenin信號通路，發揮抑制乳腺癌的作用，其機制值得進一步研究。