鹽霉素類似物的分離及抑制吲哚胺2,3-雙加氧酶活性研究

鄭 城，王 濤，謝昌賢，云喜報，盧曉霞

1中國科學院成都生物研究所，成都 610041；2金河生物科技股份有限公司，呼和浩特 010200；3中國科學院大學，北京 100049

鹽霉素(salinomycin)是從白色鏈霉菌(Streptomyces albus)培養液中分離得到的天然聚醚類離子載體型抗生素[1]，其結構中含有獨特的三螺環縮酮結構，其中一個是不飽和六元環(圖2)。由于分子內氫鍵作用，鹽霉素可以以類似環狀結構的形式存在，通常認為這與其生物活性有關[2-4]。鹽霉素一直作為抗菌藥以及獸藥被廣泛使用，近年來研究發現鹽霉素還能夠選擇性地消除腫瘤干細胞和耐藥性腫瘤細胞[7]，并且其活性比臨床常用的抗癌藥物紫杉醇活性高100倍[8]。通過其結構中含氧官能團與堿金屬離子(K+，Na+)絡合形成具有親脂性外殼的堿金屬絡合物，從而在細胞和亞細胞膜間運輸金屬陽離子并破壞Na+/K+離子平衡而誘導細胞死亡[5,6]，鹽霉素有望成為一種潛在的新型抗癌藥物[9]。然而鹽霉素的抗癌活性還需要進一步提高，而且因其具有一定的毒性，影響了其成藥性。由于在鹽霉素的發酵生產過程中會產生一系列聚醚類鹽霉素類似物[10]，為了發現具有抗癌活性的新型鹽霉素類活性化合物，我們利用高效液相色譜柱后衍生方法檢測，采用制備色譜從鹽霉素發酵粗產物中分離出兩個鹽霉素類似物，通過紅外光譜、質譜和核磁共振譜等手段表征了這兩個新化合物，并對其抑制吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)活性進行了初步研究。

1 儀器和材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，色譜柱為安捷倫公司Zorbax Rx-C8 (4.6 × 150 mm,5 μm)；島津LC-8A制備液相色譜儀(日本島津公司)色譜柱為Daisogel SP-100-8-C8-HP (41.4 × 250 mm,8 μm)，Perkin Elmer Spectrum 100紅外光譜儀(美國珀金埃爾默公司)，Perkin Elmer model 341 旋光儀(美國珀金埃爾默公司)，Bruker Avance-600 MHz 核磁共振儀(瑞士布魯克公司)，Waters Xevo TQ質譜儀(美國沃特世公司)，Varioskan Flash 全波長掃描式多功能讀數儀(美國Thermo Scientific公司)。

鹽霉素發酵粗產物由金河生物科技股份有限公司(內蒙古)提供；分析級乙酸，硫酸，乙酸鈉三水合物，乙酸銨購自Fluka Chemie公司(瑞士)；HPLC級的乙腈和甲醇購自賽默飛公司(美國)。對二甲氨基苯甲醛、碳酸氫鈉、氘代氯仿購自阿拉丁公司；用于制備流動相的水通過Millipore Milli-Q plus純化系統純化并經過去離子化和蒸餾得到。Epacadostat購自畢得醫藥公司，犬尿氨酸酶(KYNU)檢測試劑盒購自武漢優爾生公司，CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

2 實驗部分

2.1 化合物的制備

2.1.1 檢測與制備色譜條件

檢測條件為：以80%溶劑A(乙腈)+20%溶劑B(100 mM乙酸銨緩沖溶液)為流動相，設置柱溫為30 ± 0.5 ℃，流動相流速為0.6 mL/min，衍生反應溫度為95 ± 0.5 ℃，衍生試劑流速為0.7 mL/min，檢測波長為585 nm。一次和二次制備條件一致：以80%溶劑A(乙腈)+ 20%溶劑B(100 mM乙酸銨緩沖溶液)為流動相，設置柱溫為30 ± 0.5 ℃，流動相流速為50.0 mL/min，檢測波長：210 nm；脫鹽色譜條件為：以90%溶劑A(乙腈)+ 10%溶劑B(水)為流動相，設置柱溫為30 ± 0.5 ℃，流動相流速為50.0 mL/min，檢測波長：210 nm。

2.1.2 樣品前處理和化合物制備

稱取7.7 g乙酸銨于1.0 L錐形瓶，用水定容，再用冰醋酸調節pH值4.75得100 mM乙酸銨緩沖溶液；稱取25.0 g對二甲氨基苯甲醛于1.0 L錐形瓶中，加入600 mL甲醇溶解，緩慢加入12 mL硫酸，攪拌得衍生試劑。稱取約100.0 g鹽霉素發酵粗產物，置于1.0 L燒杯中，加入650 mL中性甲醇，超聲15 min，然后用3 000 rpm離心機離心15 min，0.45 μm濾膜過濾，濾液做為樣品溶液。待基線平穩后，吸取樣品溶液10 mL，注入制備色譜儀，記錄色譜圖，在制備色譜條件下對化合物A和B進行定位，然后根據分析結果計算出化合物A與化合物B在制備色譜圖上的相對保留時間分別為1.35和1.48。

吸取樣品溶液注入制備色譜儀，根據化合物A與化合物B的相對保留時間，進行分段收集。將收集液分別取樣、檢測，根據液相色譜檢測結果，將符合要求的化合物A(色譜純度大于80%)與化合物B(色譜純度大于60%)的制備液分別進行混合，得到化合物A的混合液約8.1 L，化合物B的混合液約4.2 L，濃縮，凍干得共收得一次制備化合物A約328 mg，化合物B約269 mg。將化合物A和化合物B的一次制備粉末分別加入50 mL中性甲醇溶解進行二次制備，在制備色譜儀上，進行分段收集。將收集液分別取樣、進行液相色譜儀檢測，根據檢測結果，將符合要求的化合物A與化合物B的收集液分別進行混合。得到化合物A的混合液約300 mL，化合物B的混合液約450 mL，濃縮得到化合物A的粗品溶液約40 mL，化合物B的粗品溶液約60 mL。

取鹽霉素粗品溶液10 mL，注入制備色譜儀，記錄在脫鹽色譜條件的色譜圖對化合物A和B進行定位。記錄化合物A與化合物B在脫鹽色譜圖上的出峰時間，分別吸取化合物A與化合物B的粗品溶液，注入制備色譜儀，根據定位試驗中化合物A與化合物B在制備色譜圖上的出峰時間進行分段收集，將收集液分別取樣，進行液相色譜儀檢測，根據液相色譜檢測結果，將含有化合物A與化合物B的收集液分別進行混合。得到化合物A的混合液約300 mL，化合物B的混合液約450 mL，濃縮，凍干，最后得到白色粉末化合物A約20 mg，色譜純度99.8%，白色粉末化合物B約17 mg，色譜純度98.3%。

2.2 哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制活性研究

將4-T1細胞接種于96孔板，密度1×105個/mL,培養24 h,加入INFγ(10 μg/mL)處理2 h，分別加入化合物A(10 μmol/L)、B(10 μmol/L)和Epacadostat(10 nmol/L)處理24 h,將犬尿氨酸酶抗體包被于96孔微孔板中， 加入50 μL細胞液上清，然后加入生物素化的犬尿氨酸酶抗體，洗板，加入HRP標記的親和素50 μL孵育20 min，洗板后加入TMB 45 μL孵育10 min，加終止液25 μL，立即酶標儀450 nm下測定吸光度。

將4T1細胞以104～105個細胞/孔的密度在96孔板中，細胞在CO2培養箱中37 ℃培養24 h。化合物A(10 μmol/L)、B(10 μmol/L)和Epacadostat(10 nmol/L)分別處理24 h后每個孔中加入10 μLCCK-8溶液，孵育2 h。酶標儀450 nm下測定吸光度。

3 實驗結果

3.1 鹽霉素類似物的制備

圖1 鹽霉素發酵產物的HPLC譜圖Fig.1 HPLC spectrum of salinomycin fermentation products

圖2 化合物A的HPLC譜圖Fig.2 HPLC spectrum of compound A

在鹽霉素發酵產品中，通過高效液相色譜(HPLC)柱后衍生化法檢測發現在鹽霉素主產物峰后還有兩個明顯的峰，其中兩個未知化合物A和B的含量分別達到4.13%和2.47 %(圖1)。因此利用高效液相色譜(HPLC)柱后衍生化法對A和B進行定位，采用制備色譜，經過一次制備，二次制備和脫鹽等過程制備分離得到純度分別為99.8%和結合質譜和核磁共振碳譜可確定化合物A的分子式為C43H72O11，分子量為765，比鹽霉素的分子量(751)高14個質量單位?；衔顰的1H和13C NMR譜數據與鹽霉素文獻值[11,12]基本一致，表明它們具有相同的骨架，其區別在于鹽霉素中C-40位甲基信號δH0.96 ppm和δC11.3 ppm在化合物A中消失，而出現一組新的乙基信號δH1.25～1.42,1.43～1.54 ppm 和δC16.0 ppm與 δH0.87～0.90 ppm 和δC11.8 ppm，同時，C-5和C-6的化學位移值也發生了變化分別從δC27.0 和 29.0 ppm變為 δC21.9和34.9 ppm，可將δH1.25～1.42,1.43～1.54 ppm和δC16.0 ppm 與 δH0.87～0.90 ppm和δC11.8 ppm歸屬為40-CH2和40a-CH3，因此化合物A為40-甲基鹽霉素(圖4)。

98.3%(圖2和3)的兩個新化合物A和B。

3.2 化合物A和B的表征

結合質譜和核磁共振碳譜確定化合物B的分子式為C43H72O11，分子量為765，比鹽霉素的分子量(751)高14個質量單位。化合物B的1H和13C譜數據與鹽霉素的文獻值[11,12]基本一致，表明它們具有相同的骨架，其區別在于鹽霉素中C-35位甲基信號δH0.93 ppm和δC17.9 ppm在化合物B中消失，而出現一組新的乙基信號δH0.91～0.95 ppm和δC11.0 ppm與 δH1.09～1.14,1.46～1.50 ppm和δC24.1 ppm，同時，C-14，C-13和C-15的化學位移值也發生了變化分別從δC33.6,77.4 和39.2 ppm變為 δC38.2,74.7和 34.6 ppm，可將δH0.91～0.95 ppm和δC11.0 ppm與 δH1.09～1.14,1.46～1.50 ppm和δC24.1 ppm歸屬為35a-CH3和35-CH2，因此化合物B為35-甲基鹽霉素(圖4)。

3.2 IDO抑制活性

吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)是介導色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶，其與腫瘤免疫抑制有關[13]，對化合物A和化合物B的吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制活性進行了研究，結果顯示(圖5)，化合物B能夠有效抑制犬尿氨酸的產生，且沒有細胞毒性，表明其具備一定的吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制活性。

圖5 化合物A和B的IDO抑制活性Fig.5 The IDO inhibitory activities of compounds A and B注：與空白對照組比較，* P < 0.05；** P < 0.01。Note:Compare with control,* P < 0.05;** P < 0.01.

4 結論

本論文利用制備色譜經過兩次制備和脫鹽，首次在鹽霉素發酵產物分離得到化合物A和B，通過紅外光譜、質譜和核磁共振譜等表征了這兩個新化合物。結構分析發現兩個新化合物均為鹽霉素類似物：化合物A為40-甲基鹽霉素，化合物B為35-甲基鹽霉素。生物活性研究表明，化合物B具有抑制吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)活性，可作為一種潛在的抗腫瘤藥物，值得進一步研究。