麻楝果實化學成分及其抗煙草青枯病菌活性的研究

劉 慧，劉壽柏，王 昊，陳惠琴，王 佩，梅文莉，楊克軍，戴好富*

1黑龍江八一農墾大學農學院，大慶 163000；2中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海口 571101；3海南大學熱帶農林學院，海口 570228

麻楝(ChukrasiatabularisA.Juss.)屬于楝科(Meliaceae)桃花心木亞科(Subfam.Swietenioideae)麻楝屬(Chukrasia)。該屬僅包括麻楝原種和其變種毛麻楝(Chukrasiatabularisvar.velutina)[1]。麻楝主要分布于亞洲熱帶地區，在我國海南、廣東、廣西、云南等地均有分布，別名為陰麻樹、白皮香椿。據文獻報道，三萜類化合物是楝科植物的主要化學成分[2]。迄今，國內外對麻楝化學成分及生物活性方面的研究集中于根、莖、葉上[3，4]，對果實部分的研究報道較少。麻楝中的化學成分主要為檸檬苦素型三萜[3]，除此之外，還含有甘遂烷型三萜、酚類和香豆素等類型化合物[4]。本次試驗對麻楝果實乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分的化學成分進行了研究，旨在篩選出麻楝果實中的生物活性成分，為麻楝的開發利用提供科學依據。

1 儀器與材料

旋轉蒸發儀EYELA N-1300(上海愛朗儀器有限公司)；安捷倫1260分析型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；半制備高效液相色譜儀SUMMIT P680A(美國Dionex公司)；質譜儀VG Autospec-3000(英國VG公司)；核磁共振儀Bruker AV-500(瑞士Bruker公司，TMS內標)；實驗室純水系統 Spring-R10(廈門銳思捷水純化技術有限公司)。

薄層層析硅膠板、柱色譜硅膠(200～300目)(青島海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20(瑞典GE Healthcare公司)；反相材料RP-18(日本Fuji Silysia公司)。

麻楝果實于2014年7月采自海南省海口市，由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所王軍博士鑒定為麻楝屬植物麻楝(ChukrasiatabularisA.Juss.)的果實，憑證標本(No.20140726)現存放于中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所。

2 實驗方法

2.1 提取與分離

將麻楝果實(16.0 kg)曬干后粉碎，室溫下用95%乙醇浸提3次，每次7天。所得浸提液過濾后經減壓濃縮得乙醇粗浸膏，隨后將其分散于水中成懸濁液，再依次用乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，分別經減壓濃縮得到乙酸乙酯相3 390.0 g、正丁醇相208.0 g。

乙酸乙酯相(3 390.0 g)采用正相硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(20:1～0:1)梯度洗脫，分段收集得到15個流份(Fr.1～Fr.15)。Fr.5(6.1 g)經Sephadex LH-20柱色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)分離得到4個流份Fr.5-1～ Fr.5-4。Fr.5-4經反復硅膠柱色譜分離純化得到化合物4(3.2 mg)和5(10.3 mg)。Fr.6(21.0 g)經重結晶得到化合物15(18.0 mg)；剩余樣品采用RP-18反相柱色譜，以甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，分段收集得到20個流份(Fr.6-1～ Fr.6-20)。Fr.6-13(516.8 mg)經Sephadex LH-20柱色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)分離得到3個流份Fr.6-13-1～ Fr.6-13-3。Fr.6-13-3經反復硅膠柱色譜分離純化得到化合物9(14.5 mg)、12(23.0 mg)和14(15.6 mg)。Fr.6-14(992.1 mg)經Sephadex LH-20柱色譜(甲醇)分離得到2個流份Fr.6-14-1和 Fr.6-14-2。Fr.6-14-1經反復硅膠柱色譜分離純化得到化合物7(2.7 mg)和13(6.3 mg)。Fr.6-15(321.4 mg)經Sephadex LH-20柱色譜(甲醇)分離得到3個流份Fr.6-15-1～ Fr.6-15-3。Fr.6-15-2經反復硅膠柱色譜分離純化得到化合物6(7.3 mg)、8(13.4 mg)、10(4.6 mg)和11(3.7 mg)。Fr.13(32.0 g)經重結晶及半制備型高效液相色譜儀(C18柱；45%甲醇酸水，流速4 mL/min)分離得到化合物1(43.1 mg)、2(4.0 mg)和3(15.8 mg)。

2.2 抗煙草青枯病菌活性測試

采用濾紙片瓊脂擴散法[5]測定樣品的抗煙草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)活性。用棉簽將煙草青枯病菌菌株均勻涂布后，選用直徑為6 mm的滅菌濾紙片，在其上加入10 μL的樣品溶液，待有機溶劑揮干后置于含菌平板上，每個平板放置5個濾紙片。28 ℃條件下恒溫培養12 h后觀察測試結果，用游標卡尺測量并記錄各抑菌圈直徑。

3 結果與分析

3.1 結構鑒定

化合物1白色固體(CH3OH);ESI-MS:m/z183.2 [M-H]-;分子式為C8H8O5;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.00 (2H,s,overlapped,H-2,H-6),3.76 (3H,s,7-OCH3);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:121.3 (C-1),110.0 (C-2,C-6),146.4 (C-3,C-5),139.7 (C-4),169.0 (C-7),52.3 (7-OCH3)。以上波譜數據與文獻[6]報道基本一致，故該化合物鑒定為沒食子酸甲酯 。

化合物2白色固體(CH3OH);ESI-MS:m/z197.2 [M-H]-;分子式為C9H10O5;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.00 (2H,s,overlapped,H-2,H-6),4.23 (2H,q,J=7.1 Hz,7-OCH2CH3),1.30 (3H,t,J=7.1 Hz,7-OCH2CH3);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:121.7 (C-1),109.9 (C-2,C-6),146.5 (C-3,C-5),139.7 (C-4),168.5 (C-7),61.7 (7-OCH2CH3),14.6 (7-OCH2CH3)。以上波譜數據與文獻[7]報道基本一致，故該化合物鑒定為沒食子酸乙酯。

化合物3白色晶體(CH3OH);ESI-MS:m/z169.2 [M-H]-;分子式為C7H6O5;1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.00 (2H,s,overlapped,H-2,H-6);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:121.9 (C-1),110.3 (C-2,C-6),146.3 (C-3,C-5),139.6 (C-4),170.4 (C-7)。以上波譜數據與文獻[6]報道基本一致，故該化合物鑒定為沒食子酸。

化合物15白色無定形粉末(CHCl3);ESI-MS:m/z723.5 [M + Na]+;分子式為C37H48O13;1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:7.52 (1H,s,H-21),7.41 (1H,t,J=1.6 Hz,H-23),6.45 (1H,br d,J=1.1 Hz,H-22),5.90 (1H,s,H-30),5.53 (1H,s,H-17),4.65 (1H,s,H-3),3.69 (3H,s,7-OCH3),3.23 (1H,dd,J=1.0,20.0 Hz,H-15a),2.95 (1H,dd,J=9.2,2.6 Hz,H-5),2.81 (1H,m,H-2″),2.69 (1H,dd,J=10.6,20.0 Hz,H-15b),2.55 (1H,m,H-2′),2.45 (1H,dd,J=15.9,9.3 Hz,H-6a),2.26 (1H,dd,J=15.9,2.7 Hz,H-6b),2.05 (2H,m,overlapped,H-11a,H-14),1.88 (1H,d,J=10.8 Hz,H-29a),1.73 (1H,d,J=10.8 Hz,H-29b),1.66 (3H,s,H-32),1.62 (2H,m,overlapped,H-11b,H-12a),1.28 (1H,m,H-12b),1.22 (3H,d,J=7.2 Hz,H-4′),1.18 (3H,d,J=7.2 Hz,H-4″),1.16 (3H,d,J=6.8 Hz,H-3″),1.13 (3H,s,H-19),1.07 (3H,d,J=6.8 Hz,H-3′),1.04 (3H,s,H-18),0.90 (3H,s,H-28);13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:87.3 (C-1),79.9 (C-2),83.2 (C-3),45.5 (C-4),36.9 (C-5),33.8 (C-6),173.0 (C-7),86.5 (C-8),85.7 (C-9),45.4 (C-10),25.4 (C-11),29.2 (C-12),34.6 (C-13),42.9 (C-14),26.7 (C-15),170.5 (C-16),78.6 (C-17),19.8 (C-18),16.4 (C-19),121.3 (C-20),140.8 (C-21),109.8 (C-22),143.0 (C-23),14.6 (C-28),39.6 (C-29),70.7 (C-30),119.1 (C-31),21.3 (C-32),52.2 (7-OCH3),3-isobutyryloxyl [ 176.8 (C-1′),34.7 (C-2′),18.1 (C-3′),19.7 (C-4′)],30-isobutyryloxyl [ 175.1 (C-1′′),34.6 (C-2′′),18.4 (C-3′′),19.5 (C-4′′)]。以上波譜數據與文獻[20]報道基本一致，故該化合物鑒定為phragmalin 3,30-di-isobutyrate。

3.2 活性分析

采用濾紙片瓊脂擴散法測定麻楝乙酸乙酯萃取物及單體化合物1～15的抗煙草青枯病菌活性。結果表明，乙酸乙酯萃取物在10 mg/mL濃度下對煙草青枯病菌具有中等拮抗活性(抑菌圈直徑為14.76 mm)，化合物1、2和3具有一定的拮抗活性，化合物4～15均無明顯拮抗活性，活性結果如表1所示。

表1化合物1～15(1mg/mL)對煙草青枯病菌的拮抗活性

Table 1 Inhibitory activity of compounds1-15(1 mg/mL) againstRalstoniasolanacearum

注:卡那霉素為陽性對照(1 mg/mL)。

Note:Kanamycin as positive control (1 mg/mL).

4 討論

本文采用多種柱色譜技術，從麻楝果實乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分分離鑒定了15個單體化合物，分別鑒定為：沒食子酸甲酯(1)、沒食子酸乙酯(2)、沒食子酸(3)、ozoroalide(4)、stigmast-4-en-6β-ol-3-one(5)、黃柏呈(6)、chukranin A(7)、chisopanin M(8)、21α,24α-methylmelianodiol(9)、toonaciliatin K(10)、21α,25-dimethylmelianodiol(11)、odoratone(12)、bourjotinolone A(13)、hispidone(14)和phragmalin di-isobutyrate(15)，包括9個甘遂烷型三萜，1個檸檬苦素型三萜，1個甾體和4個酚性化合物，其中化合物4～14為首次從麻楝屬植物中分離得到。麻楝植物根、莖、葉部分的化學成分研究報道多為檸檬苦素型三萜[3，4]，而本次研究發現麻楝果實中含有較多的甘遂烷型三萜和酚性化合物。本研究結果豐富了麻楝中化學成分的結構多樣性，并且首次對該屬植物中分離得到的單體化合物進行了抗煙草青枯病菌活性的研究，結果發現化合物1、2和3具有中等的煙草青枯病菌拮抗活性，這為麻楝的開發利用提供了科學依據。