螺旋藻蛋白酶解工藝的優化及螺旋藻肽的制備

孫媛媛，鄭雪君，崔春*，李齡佳，許立鏘

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640； 2.廣東真美食品股份有限公司，廣東 潮州 521000)

螺旋藻(Spirulina)，屬藍藻綱，顫藻科，是一種營養價值全面、生物活性成分豐富的低等原核生物；其蛋白含量高達60%～70%，且必需氨基酸種類齊全，組成合理，因而被認為是人類最理想的蛋白源[1,2]。近年來，生物活性肽因具有抗氧化、延緩衰老、神經調節等多種顯著的生物功效而受到人們廣泛研究[3]，而螺旋藻蛋白作為優質生物活性肽的良好來源，具有廣闊的開發前景[4]。

當前制備生物活性肽的方法主要有提取法、合成法及降解法3種，其中酶解法因反應條件溫和、工藝簡單、制備得到的活性肽穩定性較好等優點而成為制備生物活性肽的主流方法，因此本實驗選用酶解法進行螺旋藻肽酶解工藝的研究。然而，當前螺旋藻蛋白的酶解效率普遍較低，并且螺旋藻腥味重、溶解性較差，限制了其開發利用。為解決這一問題，本實驗選用破壁螺旋藻為原料，這將有利于螺旋藻腥味的脫除以及溶解性的提高[5]。在最優酶解工藝的基礎上，對制備得到的螺旋藻肽進行了多種指標的測定，以期為后續開發提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

破壁螺旋藻：廣西農墾綠仙生物保健食品有限公司；堿性蛋白酶37071：諾維信(中國)生物技術有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸鉀、甲醛等常用化學試劑：分析純，廣州市叢源儀器有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

ME204E型萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；KDN-103F微量凱式定氮儀 廣州芊薈化玻儀器有限公司；KDN-40八孔消化爐 廣州市叢源儀器有限公司；Scientz-18N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技有限公司；雷磁PHS-3E pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 螺旋藻蛋白酶解工藝單因素實驗

1.2.1 基本工藝

50 g破壁螺旋藻溶解于450 mL水中，加入螺旋藻重量0.1%的堿性蛋白酶，用NaOH溶液調整pH至一定值，55 ℃水解一定時間，8000 g離心20 min，上清液即為蛋白提取液。

1.2.2 酶解pH單因素實驗

用NaOH溶液分別調整螺旋藻溶液pH至6，7，8，9，10，加入螺旋藻重量0.1%的堿性蛋白酶，55 ℃水解9 h后離心，得到螺旋藻蛋白酶解液。

1.2.3 酶解時間單因素實驗

用NaOH溶液調整螺旋藻溶液pH至8，加入螺旋藻重量0.1%的堿性蛋白酶，55 ℃水解6，9，12，24 h，離心后得到螺旋藻蛋白酶解液。

1.2.4 熱處理單因素實驗

50 g破壁螺旋藻溶解于450 mL水中，分別置于70，80，90，100 ℃下進行熱處理30 min，而后冷卻，調節pH至8，加入螺旋藻重量0.1%的堿性蛋白酶，55 ℃水解24 h，離心后得到蛋白提取液。

1.2.5 蛋白提取液中總氮含量的測定

總氮含量由凱氏定氮法[6]測得。

1.2.6 蛋白提取液中氨氮含量的測定

α-氨基氮含量由甲醛滴定法[7]測得。

1.2.7 蛋白質回收率的計算

1.2.8 水解度的計算

水解度(%)=上清液中α-氨基氮含量/上清液總氮含量×100。

1.3 螺旋藻肽的制備及其指標測定

1.3.1 螺旋藻肽的制備

200 g破壁螺旋藻溶解于1800 mL水中，100 ℃熱處理30 min，冷卻后調pH至8，加入螺旋藻重量0.1%的堿性蛋白酶，55 ℃水解24 h，8000 g離心20 min，取上清液濃縮，真空冷凍干燥后即得螺旋藻肽。

1.3.2 螺旋藻肽產率的計算

產率(%)=螺旋藻肽質量/原料質量×100。

1.3.3 螺旋藻肽蛋白含量的測定

同1.2.5中的方法。

1.3.4 螺旋藻肽氨氮含量及水解度的計算

同1.2.6及1.2.8中的方法。

1.3.5 螺旋藻肽總糖含量的測定

依據SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸法》測定螺旋藻肽中總糖的含量。

1.3.6 螺旋藻肽分子量分布

高效液相色譜法測定分子量分布，色譜條件：流動相為乙腈+水+三氟乙酸=20+80+0.1，流速0.5 mL/min，采用7.5 mm×600 mm的分析柱(TSK-Gel)進行分析，進樣體積為20 μL。

相對分子質量標準曲線的制作：分別用流動相配成質量濃度為1 mg/mL的胰島素、桿菌肽、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸肽標準溶液，按一定比例混合后進樣，得到標準品的色譜圖。以相對分子質量的對數對保留時間作圖得到相對分子質量校正曲線及其方程：y=-3.2389x+26.438，R2=0.9607。

1.3.7 螺旋藻肽氨基酸組成的測定

按照樣品蛋白含量準確稱取樣品若干，置于水解管中，加入6 mol/L HCl 5 mL，密封。置于(110±1) ℃的烘箱中水解24 h。將水解液過濾，用水定容到50 mL容量瓶中。吸取定容后的樣品1～2 mL，置于60 ℃烘箱中脫酸。脫酸后的樣品，加入1～3 mL樣品緩沖液，震蕩均勻后用針管吸取少量，經0.22～0.45 μm濾膜過濾后裝入試劑瓶中上機分析(日立L-8900氨基酸分析儀)。

1.3.8 螺旋藻肽中金屬元素的測定

依據GB 5009.268-2016《食品中多元素的測定》方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 原料總氮含量

凱氏定氮法測得破壁螺旋藻原料的總氮含量為10.75%，即蛋白質含量為67.19%。

2.2 螺旋藻酶解工藝單因素實驗

2.2.1 酶解pH單因素實驗

pH過高或過低都會使酶發生構象變化從而導致酶活力下降，只有當酶在合適的pH范圍內才能表現出其催化活性。

圖1 酶解pH對蛋白回收率及水解度的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis pH on protein recovery and degree of hydrolysis

由圖1可知，酶解pH的變化對蛋白回收率及水解度均有顯著性影響，其中對于蛋白回收率的影響達到極顯著水平。隨著pH的升高，蛋白回收率先升高后降低，在pH 8時達到最高，為40.26%；水解度隨酶解pH的變化趨勢大致相同，但在pH為7，8，9時無顯著差異。綜上所述，得到酶解螺旋藻蛋白的最優pH為8。

2.2.2 酶解時間單因素實驗

圖2 酶解時間對蛋白回收率及水解度的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on protein recovery and degree of hydrolysis

由圖2可知，在酶解24 h內，蛋白回收率及水解度都隨著時間的增加而不斷增高，在酶解24 h時回收率及水解度均達到最高，分別為45.22%和18.80%。這說明酶解時間的增加有利于蛋白回收率的提高，后續實驗中均采用酶解24 h。

2.2.3 熱處理單因素實驗

據報道，適當的熱處理可以提高植物蛋白質的酶解效率，這主要是由于蛋白質的二級結構和聚集態發生了改變[8,9]。

圖3 熱處理對蛋白回收率及水解度的影響Fig.3 Effect of heat treatment on protein recovery and degree of hydrolysis

由圖3可知，對螺旋藻蛋白溶液進行加熱的預處理能顯著增加蛋白回收率，相較未進行熱處理的樣品，蛋白回收率能增加至少5%；熱處理溫度的增加有利于蛋白回收率的提高，其中在100 ℃熱處理后，蛋白回收率達到最高，為51.78%。水解度受熱處理的影響趨勢則相反，熱處理后，提取的蛋白溶液中水解度有明顯下降趨勢。

2.3 螺旋藻肽的制備及其指標測定

2.3.1 螺旋藻肽產率

200 g破壁螺旋藻提取得到83.02 g螺旋藻肽，產率為41.51%。

2.3.2 螺旋藻肽蛋白含量的測定

經測定，螺旋藻肽的蛋白含量為68.30%，由此計算得到蛋白回收率為42.19%。

2.3.3 螺旋藻肽氨氮含量及水解度的計算

經測定，螺旋藻肽的氨氮含量為2.23%，計算得到其水解度為20.42%。

2.3.4 螺旋藻肽總糖含量的測定

經測定，螺旋藻肽的總糖含量為7.51%。

2.3.5 螺旋藻肽分子量分布

圖4 螺旋藻肽分子量分布液相譜圖Fig.4 Liquid-phase spectrogram of molecular weight distribution of Spirulina platensis peptides

摩爾質量(Da)分布(%)500～100012.025100～50053.574<10034.401

由圖4和表1可知，經最優酶解工藝制備得到的螺旋藻肽分子量都相對較小，均低于1000 Da，其中摩爾質量在100～500之間的肽含量占比最大，約為53.6%，說明螺旋藻蛋白已經得到了充分酶解，一系列小分子肽被有效制備。小分子活性肽的制備不僅有利于酶解產物的消化吸收[10]，而且為螺旋藻功能性肽的進一步開發奠定了基礎。

2.3.6 螺旋藻肽氨基酸組成的測定

圖5 螺旋藻肽氨基酸組成液相譜圖Fig.5 Liquid-phase spectrogram of amino acid composition of Spirulina platensis peptides

氨基酸種類含量(g/100 g)氨基酸占比(%)氨基酸種類含量(g/100 g)氨基酸占比(%)Asp6.4410.75Leu5.268.79Thr3.455.77Tyr1.853.08Ser2.874.80Phe2.464.11Glu11.4719.15Lys3.696.16Gly3.215.37His0.821.36Ala5.098.51Arg2.834.73Cys0.180.30Pro2.253.75Val3.716.19必需氨基酸22.8738.20Met0.951.59非必需氨基酸37.0161.80Ile3.355.59合計59.88100

由表2可知，螺旋藻肽氨基酸種類齊全，富含賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等人體和動物的必需氨基酸以及其他非必需氨基酸。其中谷氨酸含量最高，達到11.47%，其次是天門冬氨酸，達6.44%，其他含量較高的氨基酸還有亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸等。WHO/FAO提出，必需氨基酸量/總氨基酸量=40%，必需氨基酸量/非必需氨基酸量=0.6的參考蛋白模式可提供優質蛋白質，在螺旋藻肽中，這2個值分別為38.2%與0.618，由此可以看出，該螺旋藻肽是優質的蛋白質和氨基酸來源[11]。

2.3.7 螺旋藻肽中金屬元素的測定

表3 螺旋藻肽金屬元素含量分布Table 3 Content distribution of metal elements in Spirulina platensis peptides mg/kg

由表3可知，根據GB 2762-2017《食品中污染物》以及GB 19643-2016《藻類及其制品》等國家標準，螺旋藻肽中鉛、砷、鎘、汞、鉻等重金屬元素均未超標，且其突出的特點是鎂元素含量豐富，可達到430 mg/kg。

3 結論

螺旋藻蛋白酶解的最佳工藝條件為：酶解pH 8，酶解時間24 h，熱處理100 ℃；此時，蛋白回收率達到51.78%，水解度為13.16%。

在最佳酶解工藝的基礎上，制備得到的螺旋藻肽蛋白含量為68.30%，蛋白回收率為42.19%，水解度為20.42%，總糖含量為7.51%。此外，分子量結果顯示：螺旋藻肽的分子量都低于1000 Da，說明一系列小分子肽被成功制備，且氨基酸結果顯示：螺旋藻肽中含有豐富多樣的氨基酸，其中谷氨酸的含量最高。

經檢驗結果表明，螺旋藻肽中無重金屬元素超標，且其中含有豐富的鎂元素，同時含有硒、銅、鐵、鈣、鋅等對人體有益的元素。

綜上所述，該實驗通過一系列探索，得到了螺旋藻蛋白的最優酶解工藝，從而制備了一種溶解性好的螺旋藻肽，并且通過一系列數據對螺旋藻肽的各種性質進行了表征，從而為螺旋藻肽的進一步開發利用提供了數據支撐，以期為螺旋藻功能性肽的開發奠定基礎。