不同腌制方法對山葵酸菜中亞硝酸鹽含量的影響

王躍華，王宗兵，許芮菡，劉洪明，戴靜，李亞林

(成都大學 生物工程學院，成都 610106)

腌菜是我國傳統的蔬菜制品，分為非發酵蔬菜制品和發酵蔬菜制品。非發酵蔬菜制品腌制過程中用鹽量較大，微生物發酵作用不明顯。發酵蔬菜制品在腌制時用鹽量較少，腌漬過程中有旺盛的乳酸發酵作用。這類產品一般都具有明顯的酸味，主要包括泡菜和酸菜等[1，2]。

中國腌菜擁有廣闊的國際市場，其中以四川的腌制蔬菜最為出名，但在國際市場上卻不如韓國與日本。為滿足人們不同的消費嗜好，增強我國酸菜在國際市場的競爭力，開展腌菜質量研究發展十分重要。然而腌菜中亞硝酸鹽含量超標一直都是廣受消費者關注的問題，我國食品衛生法規定了腌制品中亞硝酸鹽含量應小于30 mg/kg[3，4]。

研究表明，蔬菜中亞硝酸鹽的由來，主要是高等植物在生長過程中要利用土壤中的硝酸鹽生成菌轉化硝酸鹽來合成自身生長必需的蛋白質，當氣候干旱、光照不足、氮肥量大時，造成植物代謝混亂，而硝酸鹽因無法有效利用而堆積于植物體內，在硝酸還原酶的作用下生成亞硝酸鹽。當人體和食物中的亞硝酸鹽和胺類或酰胺同時存在時，就會形成亞硝胺，亞硝胺是一級化學致癌物質，會誘發消化系統癌變。因此，阻斷亞硝酸鹽合成或消除亞硝胺的前體是防治癌病的有效途徑之一。

本實驗利用不同的傳統腌制方法組合腌制酸菜，并采用鹽酸萘乙二胺比色法[5-7]測定了山葵酸菜從腌制開始到成熟的過程中亞硝酸鹽的變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料

制作酸菜原料：新鮮山葵葉(采自廣元山葵種植基地)；老酸菜(連續發酵1年的山葵老酸菜)、酸菜水(連續發酵1年的山葵酸菜水)及普通泡菜水，均由廣元市璽府生物科技有限公司提供；面水為10 g面粉溶于250 g水中煮開即可。

1.2 儀器與試劑

玻璃罐(500 mL)、HH-4S水浴鍋、FA1204B/0.0001 g電子分析天平、UV-2201型紫外-可見分光光度計：日本島津公司；高速組織攪拌器、去離子水、各種試劑參照國標配制，各種藥品均采用分析純(A.R.)。

1.3 標準曲線的繪制

分別吸取不同量的亞硝酸鈉標準溶液于比色管中構成不同亞硝酸鹽濃度，加入4 g/L對氨基苯磺酸2 mL，搖勻靜止3 min，加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺，加水定容至刻度，靜置15 min。于波長538 nm處測定吸光度，得標準曲線為y=0.61289x+0.01271, r=0.99926，線性范圍為0～1.4 μg/mL。

1.4 樣品的提取及凈化

取適量已腌制的山葵酸菜于粉碎機中粉碎，稱取5 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL燒杯中，加入12.5 mL的飽和硼砂溶液，再用300 mL的70 ℃水將其洗入500 mL容量瓶中，在沸水中水浴加熱15 min后冷至室溫。

冷卻至室溫后，加入5 mL亞鐵氰化鉀，搖勻，再加5 mL乙酸鋅溶液以沉淀蛋白質。加去離子水至刻度，搖勻，倒入500 mL燒杯中，放置30 min后，上清液用濾紙過濾，棄去初液30 mL，濾液備用測量。

1.5 樣品提取液的測量

取提取液40 mL于比色管中，加入4 g/L對氨基苯磺酸2 mL，搖勻，靜置3 min。加入2 g/L鹽酸萘乙二胺1 mL，加水定容至刻度，靜置15 min。在波長538 nm處測定吸光度，帶入標準曲線方程計算相應濃度及樣品亞硝酸含量。

1.6 山葵酸菜腌制的配方

山葵酸菜腌制的配方見表1。

表1 山葵酸菜腌制配方Table 1 Curing formula of pickled Wasabia japonica g

注：配方中外加輔助發酵物質即代表相應腌制方法。

1.7 發酵母液乳酸菌的測定

參照國標給出的計數方法，在超潔凈工作臺中取老酸菜、酸菜水、泡菜水各10.00 g溶于100 mL無菌生理鹽水中，同時攪拌20 s使老酸菜上菌體充分溶于無菌生理鹽水中，取1 mL液體加入到9 mL無菌生理鹽水中，適當稀釋后各選擇3個合適的梯度稀釋液，分別取100 μL涂布于MRS固體培養基、YPD固體培養基和結晶紫中性紅膽鹽瓊脂固體培養基中，每個梯度做2次平行涂布。將MRS固體培養基置于37 ℃培養箱中培養48 h，YPD固體培養基置于30 ℃培養箱中培養3～5天，結晶紫中性紅膽鹽瓊脂固體培養基置于37 ℃培養箱中培養24 h后計數。最后細菌計數選取平板菌數在30～300之間的平板進行數目分析計算，真菌計數選取平板菌數在10～100之間的平板進行數目分析計算。菌落計算公式：乳酸菌濃度=(菌落數×稀釋倍數)/樣品質量。

2 結果與分析

2.1 各外加輔助發酵物質乳酸菌含量

老酸菜：4.0 lg(CFU/g)、酸菜水：5.5 lg(CFU/g)、泡菜水：4.8 lg(CFU/g)。

2.2 各外加輔助發酵物質對酸菜亞硝酸鹽含量的影響

2.2.1 酸菜水和面水對酸菜亞硝酸鹽含量的影響

分析酸菜腌制過程中加了酸菜水時，再加面水對腌制過程中亞硝酸鹽含量的影響。

圖1 酸菜水和酸菜水+面水比較圖Fig.1 Comparison chart of pickled Chinese cabbage water and pickled Chinese cabbage water+flour water

由圖1可知，在腌制酸菜過程中，無論是A1還是A2，其亞硝酸鹽峰值均在10 mg/kg以下。在山葵酸菜的腌制過程中，加酸水其發酵作用強，使發酵過程中亞硝酸鹽含量低，再加面水能顯著延遲亞硝峰的出現。原因是A2中面水作為雜菌與乳酸菌生長的培養基，促使發酵前期雜菌與乳酸菌含量較A1組大，而A1由于無面水促進菌體生長，其乳酸菌利用其酸性環境緩慢生長，雖然前期雜菌產生的亞硝酸鹽被積累，但雜菌數量與A2相比較少，第4天后乳酸菌數量增大到足夠量，其能迅速降解前期積累的亞硝酸鹽。而A2短時間內產生較大量雜菌與乳酸菌，乳酸菌利用其酸性環境與菌種優勢的能力較A1小，雜菌產生較大量亞硝酸鹽，同時乳酸菌也消除相應亞硝酸鹽，亞硝酸鹽的產生與消除平衡使亞硝酸鹽一直處于較低但依然上升的狀態，導致A2組較A1組亞硝峰推遲并降低。同時在腌制后期由于A2含有更多的雜菌，其后期乳酸菌菌種優勢較A1小，亞硝酸鹽消除較A1慢，因此后期亞硝酸鹽量A2>A1。此外加面水實驗組亞硝峰的峰值比不加面水低，原因可能是面水促進乳酸菌的生長，乳酸菌的快速繁殖產生乳酸及乳酸菌自身酶系統降解腌制過程中產生的亞硝酸鹽[8]。

2.2.2 酸菜水、面水、老酸菜對酸菜亞硝酸鹽含量的影響

圖2 酸菜水、酸菜水+面水、老酸菜、老酸菜+面水配對比較圖Fig.2 Comparison chart of pickled Chinese cabbage water, pickled Chinese cabbage water+flour water,mature pickled Chinese cabbage,mature pickled Chinese cabbage water+flour water

分析酸菜腌制過程中加了老酸菜時，再加面水對腌制過程中亞硝酸鹽含量的影響，同時比較酸菜腌制過程中加酸菜水與加老酸菜兩種對應腌制方法對酸菜腌制過程中亞硝酸鹽含量的影響。

由圖2可知，比較A3與A4，在加了老酸菜的基礎上再加面水的蔬菜腌制過程中亞硝峰出現比不加面水早，并且總的亞硝酸鹽含量更低。其原因是A3、A4加入的老酸菜中乳酸菌含量較少，為4.0 lg(CFU/g)，而原料中雜菌較多，因此A3、A4乳酸菌菌種優勢小[9]，面水更能促進雜菌的生長，其亞硝酸鹽產量迅速上升，因此前2天A4亞硝酸鹽含量較A3多。在高亞硝酸鹽濃度下，乳酸菌降低亞硝酸鹽作用更加明顯，導致亞硝峰提前。比較A1與A3，A2與A4，在酸菜發酵的整個過程中，加酸菜水比加老酸菜的亞硝酸鹽含量更低，亞硝峰出現明顯延遲，并且加酸菜水實驗組峰值僅為不加酸菜實驗組的1/4。可以看出，在腌制蔬菜的過程中，加酸菜水比加老酸菜更能有效降低亞硝酸鹽含量，原因是加的酸菜水中比加的老酸菜中含有更多的乳酸菌，A1、A2乳酸菌菌種優勢較A3、A4大，能有效抑制雜菌的生長，從而抑制亞硝酸鹽的產生[10]。另外，加酸水菜的蔬菜中pH更低，有利于乳酸菌生長進而抑制雜菌的生長。此外酸也能使產生的亞硝酸鹽分解，從而使亞硝酸鹽含量降低，同時使亞硝峰延遲。

2.2.3 3種外加輔助發酵物質的亞硝酸鹽含量降低效果

分析比較3種外加輔助發酵物質(酸菜水、老酸菜、面水)對酸菜腌制過程中亞硝酸鹽含量降低的能力。

圖3 酸菜水、老酸菜、面水比較圖Fig.3 Comparison chart of pickled Chinese cabbage water, mature pickled Chinese cabbage,flour water

由圖3可知，比較A3與A5得出，僅加老酸菜較僅加面水能快速降解腌制過程中產生的亞硝酸鹽，并且使亞硝峰提前，整個腌制過程亞硝酸鹽含量更少，原因是僅加面水乳酸菌含量較僅加老酸菜乳酸菌含量少，僅來源于原料自帶乳酸菌，面水促進雜菌與乳酸菌生長過程中，前4天亞硝酸鹽產生量大于消除量，亞硝峰推遲。并且由于A5后期雜菌較多，乳酸菌菌種優勢不顯著，所以后期亞硝酸鹽降低較為緩慢。在研究腌制酸菜過程中降低亞硝酸鹽含量的方法中，根據其整個腌制過程中亞硝酸鹽含量降低效果對3種腌制過程中添加的外加輔助發酵材料排序，效果由好到差依次為：酸菜水>老酸菜>面水。

2.2.4 酸菜水、面水、老酸菜降低亞硝酸鹽含量能力比較

分析確定酸菜腌制過程中，加入的酸菜水與老酸菜處于發酵降低亞硝酸鹽主導地位，面水處于輔助地位。

圖4 酸菜水+面水、老酸菜+面水、面水比較分析圖Fig.4 Comparison and analysis chart of pickled Chinese cabbage water+flour water,mature pickled Chinese cabbage+flour water,flour water

由圖4可知，3個實驗組均加有面水，A5為僅加入面水實驗組，其整個腌制過程亞硝酸鹽前5天均處于超過國家標準水平的狀態。A5基礎上加入老酸菜后即A4組，整個腌制過程中亞硝酸鹽相對于A5實驗組降低明顯，尤其是達到峰值后亞硝酸鹽降解速度明顯加快。若在A5基礎上加入酸菜水即A2實驗組，其整個腌制過程亞硝酸鹽降低顯著，其峰值僅為A5的1/4。由此比較說明，3個外加輔料中加入酸菜水與老酸菜處于發酵降低亞硝酸鹽主導地位，面水處于輔助地位。

2.2.5 食鹽和泡菜水對酸菜亞硝酸鹽含量的影響

圖5 食鹽、食鹽+泡菜水對比圖Fig.5 Comparison chart of salt,salt+pickle water

由圖5可知，所取泡菜水本身含有亞硝酸鹽，但整個腌制過程中“泡菜水+食鹽”對應腌制方法的酸菜亞硝酸鹽含量更低，并且降解的速率也較快，原因是泡菜水比蔬菜自身含有更多的乳酸菌[11]，同時食鹽形成的高滲透環境抑制雜菌生長，酸性環境既促進乳酸菌生長又促進亞硝酸鹽降解，從而能有效降解蔬菜腌制過程中產生的亞硝酸鹽。因此在腌制蔬菜時，加入適量的泡菜水與食鹽能有效降解酸菜腌制過程中的亞硝酸鹽，而且其整個腌制過程中亞硝酸鹽含量均在8 mg/kg以下。另外，僅加食鹽其亞硝酸鹽含量也在12 mg/kg以下，與僅加面水相比能顯著降低亞硝酸鹽含量，其原因是高濃度的食鹽對細菌有抑制作用，雖然乳酸菌同時被抑制，但雜菌產生的亞硝酸鹽較少，同時乳酸菌逐漸形成的酸性環境有利于乳酸菌生長，因此酸菜中亞硝酸鹽處于一個較低的水平。

2.2.6 7種酸菜腌制方法的亞硝酸鹽含量降低效果

圖6 7種腌制方法亞硝酸鹽平均含量柱狀圖Fig.6 Column chart of average nitrite content in seven pickling methods

各實驗組整個發酵過程亞硝酸鹽平均含量可間接反應各實驗組發酵過程亞硝酸鹽總含量。由圖6可知，A1組平均亞硝酸鹽濃度最小，但A2與A1僅相差0.25 mg/kg，非常接近，且由前面分析可知A2亞硝峰更低，所以A1與A2所對應腌制方法的選擇可根據實際應用需求確定。以各實驗組亞硝酸鹽平均濃度為標準為各實驗組亞硝鹽降低效果從大到小排序為：A1>A2>A6>A7>A4>A3>A5。

3 結論

酸菜水與面水同時加入是幾種實驗組中降低亞硝酸鹽最顯著的方法，并且其推遲亞硝峰的出現。食鹽與泡菜水都能顯著降解整個腌制過程中的亞硝酸鹽，但在食鹽基礎上加入泡菜水能使整個腌制過程中的亞硝酸鹽更低。

在腌制蔬菜的過程中，加入適量的酸菜水、老酸菜、泡菜水、食鹽都能降低蔬菜腌制過程中產生的亞硝酸鹽。7種組合腌制方法中降低亞硝酸鹽效果以亞硝酸鹽平均濃度為標準從大到小排序為：A1>A2>A6>A7>A4>A3>A5。以各實驗組亞硝峰的峰值為標準從大到小排序為：A2>A7>A1>A6>A4>A3>A5。在本研究方案下，亞硝酸鹽消除效果為：南方北方腌制方法結合>南方腌制方法>北方腌制方法。

無論哪種腌制方法，在腌制過程中都會產生亞硝酸鹽，并且都會出現一個“亞硝峰”，這一“亞硝峰”是不可消除的[12]。以山葵為材料，加入酸菜水、泡菜水、食鹽所對應的腌制方法其亞硝峰都低于食品監管標準30mg/kg，即整個腌制過程中都可食用。但是新鮮蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量與蔬菜的種屬、生長期、栽培條件及蔬菜部位等因素有關。新鮮蔬菜的硝酸鹽與亞硝酸鹽含量大，則酸菜腌制過程中亞硝酸鹽含量也大，反之亦然。但總體來說，若采用本實驗中降低亞硝酸鹽效果較好的幾種方法會使整個腌制過程中亞硝酸鹽含量低于30mg/kg，整個腌制過程都可以食用。

4 展望

接種乳酸菌發酵制作的泡菜風味由于其菌種單一，沒有自然發酵風味好[13，14]，酸菜與泡菜發酵原理基本相同，所以其風味也是自然發酵更好。因此，本實驗目的在于對生活中常用酸菜腌制方法進行研究與改進，完全采用日常生活中酸菜的腌制方法。為了便于生活運用，本實驗以輔助發酵物質的添加量為標準，并未按照乳酸菌的量進行特殊輔助發酵物質的添加。在實際運用過程中可能會出現由于外加輔助發酵物質的乳酸菌含量不同，導致與本實驗結果有所差別的現象，因此本實驗給出了外加輔助發酵物質中乳酸菌含量以供實踐者參考，同時也能啟發相關食品工廠根據此參數進行定量研究生產。