傳統發酵豆制品中納豆激酶產生菌的篩選及發酵培養基的優化

滿麗莉,向殿軍

(1.內蒙古民族大學 生命科學學院，內蒙古 通遼 028042；2.內蒙古民族大學 農學院， 內蒙古 通遼 028042)

血栓會導致心肌梗死、肺栓塞等疾病，近年來發病率和死亡率顯著上升，但目前常用的纖溶藥物具有作用時間短、價格高、來源受限、有出血風險等缺陷，開發新的纖溶藥物已成為亟待解決的問題[1,2]。納豆激酶具有安全、易吸收、作用時間長、不易導致出血傾向、成本低廉和來源廣泛等眾多優點，作為一種新型的溶血栓藥物備受關注[3-6]。中國傳統調味品是產納豆激酶菌株的良好來源，菌株的篩選是提高納豆激酶合成量的基礎和前提條件，有利于其工業化應用，發酵培養基組成是影響納豆激酶合成量的主要因素之一[7]。大規模發酵的不確定性通常是由于對變量交互作用缺乏了解所導致的，響應面法可在相對少的試驗次數和較低的成本下研究各因素對納豆激酶合成的影響及變量間的交互作用，通過數學模型的構建準確描述整個過程[8]。本研究從傳統發酵豆制品中篩選并鑒定1株納豆激酶高產菌株，通過單因素試驗及響應面法探討各因素之間的交互作用，確定最佳產酶培養基組成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

供試樣品為自然發酵納豆、市售的豆豉及納豆。

1.1.2 試劑及培養基

試劑：凝血酶，購自中國藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原和瓊脂糖，購自美國Sigma公司；其他藥品，均為國產分析純。

基礎種子培養基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2～7.4。

基礎發酵培養基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.2～7.4。

脫脂牛乳平板：5 g脫脂乳粉及1.5 g瓊脂分別溶于50 mL蒸餾水后分開滅菌，冷卻至50 ℃時混勻倒平板。

1.1.3 主要儀器設備

SW-CT型超凈工作臺 鄭州南北儀器設備有限公司；MJ-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋 北京天賜科儀商貿有限公司；BPH-9082型電熱恒溫培養箱 濟南來寶醫療器械有限公司；Microfuge 16型離心機 美國貝克曼公司；WS-600型恒溫振蕩培養箱 德國Wiggens公司；110-801型三量ip67防水原點數顯卡尺不銹鋼零點電子游標尺 東莞市景有模具五金有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養及發酵方法

培養方法：挑取菌株接種于裝有50 mL基礎種子培養基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，180 r/min條件下震蕩培養12 h(OD600=1.5～1.6)。

發酵方法：將菌液按5%接種于裝有50 mL基礎發酵培養基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，180 r/min條件下震蕩培養72 h后，發酵液以5000×g離心10 min后，取10 μL上清液用于納豆激酶活性的測定。

1.2.2 納豆激酶活力的測定

納豆激酶活力的測定采用纖維蛋白平板法[9]。溶圈直徑采用電子游標尺測定。

1.2.3 納豆激酶產生菌的篩選及鑒定

1.2.3.1 菌株的篩選

用10 mL無菌生理鹽水洗滌5～7粒納豆或豆豉，將洗滌液分裝于離心管中，5000×g，10 min離心后收集菌體，制備菌懸液，95 ℃水浴處理5 min，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋菌懸液，取10-3，10-4，10-53個梯度分別吸取100 μL涂布于脫脂牛乳平板，37 ℃培養20 h，選擇透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌落挑菌，經反復純化后保藏。挑取菌株按1.2.1方法培養發酵測定納豆激酶活性，篩選出溶圈直徑最大的菌株進行鑒定及發酵培養基優化。

1.2.3.2 菌株的鑒定

1.2.4 納豆激酶發酵培養基的優化

1.2.4.1 碳源種類及濃度對納豆激酶合成的影響

運用1%、2%、3%、4%的蔗糖、玉米淀粉、麩皮、可溶性淀粉分別代替基礎發酵培養基中2%的葡萄糖，其他成分不變，以基礎發酵培養基為對照。溫度37 ℃，轉速180 r/min，振蕩培養72 h，測定溶圈直徑，選取適宜的碳源種類及其濃度。

1.2.4.2 氮源種類及濃度對納豆激酶合成的影響

運用1%、2%、3%、4%的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕粉、硫酸銨分別代替基礎發酵培養基中2%的蛋白胨，其他成分不變，以基礎發酵培養基為對照。溫度37 ℃，轉速180 r/min，振蕩培養72 h，測定溶圈直徑，選取適宜的氮源種類及其濃度。

1.2.4.3 無機鹽種類及濃度對納豆激酶合成的影響

通用電氣公司把企業文化視為最好的精神黏合劑，把公司所有人緊緊團結在一起，向著共同的愿景目標，協調一致，努力奮斗，從而把通用電氣打造成一個年輕而有活力的企業。韋爾奇告誡大家：“人才即是一切，有人才的公司才能成為最大的贏家。”“投資于人才”是通用電氣公司核心的管理文化——人才是企業的核心力量，優秀人才是公司最重要的戰略資源，是企業價值的主要創造者。在人才全球化戰略的指引下，全球范圍內尋找最優秀的人才，挖掘有潛力的人才，留住一流的人才，挑選好接班人，始終是通用電氣公司最重要的戰略規劃。通用電氣公司的每一個企業都重用當地人才，同時注重培養其全球化工作能力，實現了人才的“全球本土化和本土全球化”。

采用不同濃度的K2HPO4∶KH2PO4(0.1%∶0.1%、0.2%∶0.1%、0.6%∶0.1%)、MnSO4·H2O(10-5，10-4，10-3mol/L)、CaCl2(0.02%、0.04%、0.06%)、MgSO4(0.02%、0.04%、0.06%)分別代替基礎發酵培養基中0.5%的NaCl，其他成分不變，以基礎發酵培養基為對照。溫度37 ℃，轉速180 r/min，振蕩培養72 h，測定溶圈直徑，選取適宜的無機鹽種類及其濃度。

1.2.4.4 表面活性劑種類及濃度對納豆激酶合成的影響

運用0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的吐溫40、吐溫80、羧甲基纖維素、聚乙二醇分別添加到基礎發酵培養基中，其他成分不變，以基礎發酵培養基為對照。溫度37 ℃，轉速180 r/min，振蕩培養72 h，測定溶圈直徑，選取適宜的表面活性劑種類及其濃度。

1.2.4.5 響應面法優化納豆激酶發酵培養基

應用Design-Expert軟件中的Box-Benhnken設計構建模型，響應面法尋找最佳發酵培養基。以可溶性淀粉(A)、大豆蛋白胨(B)、氯化鈣(C)、硫酸鎂(D)、羧甲基纖維素(E)5個因素為自變量，溶圈直徑(mm)為響應值，運用五因素三水平的響應面分析試驗，共46個試驗點，其中40個為析因子，6個為中心試驗。試驗因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test %

1.2.5 數據分析

應用SPSS 17.0軟件中的One-Way Analysis of Variance(ANOVA)計算標準差。采用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Benhnken設計進行響應面數據分析。

2 結果與討論

2.1 菌株的篩選

運用脫脂牛乳平板法從自然發酵納豆、市售的納豆及豆豉中初篩出60株蛋白酶產生菌株，采用纖維蛋白平板法從豆豉中復篩出1株納豆激酶活性顯著較高的菌株(P<0.01)，命名為菌株MX-6，溶圈直徑高達(21.60±0.48) mm。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌落形態及菌體形態

圖1 菌株MX-6的菌落形態(a)及菌體形態(b)Fig.1 Colony morphology (a) and bacterial morphology (b) of strain MX-6

菌株MX-6的菌落呈白色，不規則圓形，邊緣呈波狀，有褶皺，中央凸起，不透明，無光澤(見圖1a)。顯微鏡觀察結果顯示菌株MX-6為革蘭氏染色陽性，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，以單個或短鏈狀存在，芽孢為橢圓形，偏端生，芽孢囊無明顯膨大(見圖1b)。

2.2.2 生理生化鑒定

表2 菌株MX-6的生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical identification of strain MX-6

由表2可知，菌株MX-6具有枯草芽孢桿菌屬的典型特征。

2.2.3 菌株MX-6的16S rDNA基因擴增及同源性分析

圖2 菌株MX-6的DNA(a)及16S rDNA基因(b)Fig.2 DNA (a) and 16S rDNA gene (b) of strain MX-6

以菌株MX-6的總基因組DNA為模板(見圖2a)，應用簡并引物擴增16S rDNA基因片段，獲得的序列片段長度為1542 bp(見圖2b)，其序列與GenBank中已公布的枯草芽孢桿菌168(NR102783.1)的16S rDNA基因序列同源性高達99%以上，證明菌株MX-6為枯草芽孢桿菌。

2.3 不同碳源及濃度對納豆激酶活力的影響

表3 碳源對枯草芽孢桿菌MX-6產納豆激酶的影響Table 3 Effect of carbon source on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表3可知，蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉及2%的麩皮作為碳源均能顯著提高納豆激酶的合成量(P<0.01)，3%的可溶性淀粉作為碳源時，納豆激酶產量最高，溶圈直徑最大為，29.94 mm。

2.4 不同氮源及濃度對納豆激酶活力的影響

表4 氮源對枯草芽孢桿菌MX-6產納豆激酶的影響Table 4 Effect of nitrogen source on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表4可知，胰蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕粉作為氮源均能顯著提高納豆激酶的合成量(P<0.01)，而硫酸銨作為氮源會降低納豆激酶的合成量(P<0.01)，2%的大豆蛋白胨作為氮源時，納豆激酶產量最高，溶圈直徑最大，為31.06 mm。

2.5 不同無機鹽及濃度對納豆激酶活力的影響

表5 無機鹽對枯草芽孢桿菌MX-6產納豆激酶的影響Table 5 Effect of inorganic salt on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表5可知，MnSO4·H2O會顯著抑制納豆激酶的合成(P<0.01)，K2HPO4和KH2PO4對納豆激酶合成的影響不大(P>0.05)，而MgSO4和CaCl2有利于提高納豆激酶合成量(P<0.01)，兩者的添加量為0.04%時，溶圈直徑分別達到26.21 mm和26.82 mm。

2.6 不同表面活性劑及濃度對納豆激酶活力的影響

表6 表面活性劑對枯草芽孢桿菌 MX-6產納豆激酶的影響Table 6 Effect of surfactants on nattokinase produced by Bacillus subtilis MX-6

由表6可知，吐溫40、吐溫80、羧甲基纖維素和聚乙二醇有利于納豆激酶的合成(P<0.01)，添加0.4%的羧甲基纖維素時，納豆激酶產量最高，溶圈直徑最大，為29.13 mm。

2.7 響應面法優化納豆激酶發酵培養基

2.7.1 模型建立及顯著性分析

以溶圈直徑為響應值，運用Box-Benhnken設計46組實驗(見表7)。二次回歸模型為：Y=-115.47771+14.91187A+9.75708B+1960.04167C+2093.20833D+196.8604-0.042500AB-26.25000AC-33.75000AD-0.25000AE+1.00000BC-22.75000BD-0.45000BE-2025.00000CD-50.00000CE-292.50000DE-2.12292A2-2.24208B2-22720.83333C2-22354.16667D2-231.95833E2。

式中：Y為抑菌圈直徑的預測值，A為可溶性淀粉的編碼值，B為大豆蛋白胨的編碼值，C為氯化鈣的編碼值，D為硫酸鎂的編碼值，E為羧甲基纖維素的編碼值。

表7 Box-Benhnken試驗設計及結果Table 7 Design and results of Box-Benhnken experiment

續 表

表8 二次模型的方差分析Table 8 Analysis of variance (ANOVA) for the quadratic model

注：“*”表示顯著(P<0.05)，“**”表示極顯著(P<0.01)；“-”表示不顯著。

由表8可知，該模型的P<0.01，表明試驗所采取的二次模型極顯著。失擬項的P=0.1004>0.05，模型失擬項不顯著，決定系數R2=0.9925，表明模型與實際情況擬合度較高，所以可應用該模型對試驗結果進行預測和分析。該模型中A、B、C、D、E、AD、DE、A2、B2、C2、D2、E2的P<0.01，表明可溶性淀粉、大豆蛋白胨、氯化鈣、硫酸鎂、羧甲基纖維素、可溶性淀粉和硫酸鎂的交互作用、硫酸鎂和羧甲基纖維素的交互作用、可溶性淀粉的平方、大豆蛋白胨的平方、氯化鈣的平方、硫酸鎂的平方、羧甲基纖維素的平方對納豆激酶合成量的影響極顯著。AC、BD、CD的P<0.05，表明可溶性淀粉和氯化鈣、大豆蛋白胨和硫酸鎂、氯化鈣和硫酸鎂的交互作用對納豆激酶合成量的影響顯著。交互項AB、AE、BC、BE、CE的P>0.05，表明可溶性淀粉和大豆蛋白胨、可溶性淀粉和羧甲基纖維素、大豆蛋白胨和氯化鈣、大豆蛋白胨和羧甲基纖維素、氯化鈣和羧甲基纖維素的交互作用對納豆激酶合成量無顯著性影響。

2.7.2 響應面分析

各因素的變化范圍分別為可溶性淀粉2%～4%，大豆蛋白胨1%～3%，氯化鈣0.03%～0.05%，硫酸鎂0.03%～0.05%，羧甲基纖維素0.30%～0.50%。在分別分析兩個因素之間的交互作用時，其中一個因素固定，隨著另一個因素濃度的增加，納豆激酶的合成量均呈現先增加后減少的趨勢(見圖3)，說明各因素的最佳濃度在選定的范圍內。優化發酵培養基為可溶性淀粉2.91%、大豆蛋白胨1.92%、氯化鈣0.04%、硫酸鎂0.04%、羧甲基纖維素0.39%。預測的溶圈直徑為33.84 mm。

圖3 兩兩因素之間的響應面圖Fig.3 Response surface graphs between two factors

2.7.3 回歸模型的驗證試驗

為檢驗預測結果的可靠性，采用優化培養基進行驗證試驗。實際溶圈直徑為(33.87±0.12) mm，與預測的溶圈直徑33.84 mm相比較差異不顯著(P>0.05)，表明該模型可靠性好。與優化前的溶圈直徑(21.60±0.48) mm 相比較，溶圈直徑提高了56.81%，可見該模型能較好地預測納豆激酶的合成情況。

3 結論

由于納豆激酶的溶栓效果遠遠大于彈性蛋白酶和纖溶酶，具有生產周期短、成本低、產量高等優點，使其成為研究熱點[9,10]。從中國豆豉中篩選獲得1株納豆激酶高產菌株MX-6，經菌落形態、菌體形態和16S rDNA基因同源性分析鑒定為枯草芽孢桿菌，該菌株來源于中國傳統調味品，是農業部和FDA認定的安全性菌株，可用于研究其液體發酵合成納豆激酶，進行溶栓藥物開發。提高納豆激酶合成量的主要途徑包括：篩選納豆激酶高產菌株；物理或化學誘變選育；優化發酵條件或培養基。由于枯草芽孢桿菌在非適宜營養條件下極易形成休眠體——芽孢，導致產酶終止，所以優化培養基組成是顯著提高納豆激酶合成量的有效途徑之一[11,12]。本研究應用響應面法對枯草芽孢桿菌MX-6產納豆激酶的發酵培養基進行優化，獲得的最佳發酵培養基為：可溶性淀粉2.91%、大豆蛋白胨1.92%、氯化鈣0.04%、硫酸鎂0.04%、羧甲基纖維素0.39%。在該發酵培養基中所產納豆激酶的溶圈直徑可高達33.87 mm，與響應面預測值相比差異不顯著，表明響應面模型的可行性和可靠性，所以本試驗優化獲得的最佳產酶培養基切實可行，可為納豆激酶的工業化生產奠定基礎。