低糖腌制韭菜根中優勢腐敗菌的分離與鑒定

胡秀虹，張廷輝，李建會，李培,3，王翔,3*

(1.凱里學院 大健康學院，貴州 凱里 556011；2.黔東南州食品藥品檢驗檢測中心， 貴州 凱里 556011；3.黔東南民族藥綜合利用工程技術研究中心，貴州 凱里 556011)

腌韭菜根是用寬葉韭(AlliumhookeriThwaites)的肉質根拌以鹽、糖等輔料加工制成的產品。寬葉韭又稱大葉韭，百合科蔥屬多年生宿根性植物，是以根莖為主要食用部位的韭菜，原產于云、貴、川和西藏[1,2]。貴州黔東南麻江縣“壩芒”牌腌韭菜根是以糖粉、辣椒面等為輔料，在無任何防腐劑、色素添加下，經傳統的腌制工藝加工而成，其營養價值豐富，具有特殊的辛香味，是一款本土特色食品[3]。

目前，腌韭菜根的生產還處于作坊式加工狀態，生產環境條件差、生產技術相對落后且缺乏相應的操作規范，故在加工生產中，往往易造成產品質量不統一、貨架期短等問題。袋裝腌韭菜根，由于是低糖腌制，又不加任何防腐劑，在貯、運、銷過程中易被微生物污染，發生脹袋變質。故本研究以脹袋變質的真空包裝韭菜根為原料，從中分離篩選出優勢腐敗菌，通過形態學特征、生理生化試驗和16S rRNA基因序列分析鑒定出引起真空包裝韭菜根脹袋變質的主要微生物，以期為腌韭菜根的生產工藝及微生物污染的有效控制提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

低糖腌制韭菜根：由貴州麻江裕沃生態農業發展有限公司提供；營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基：均購于北京奧博星生物技術有限責任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增引物：購于上海生工生物工程股份有限公司；生理生化試劑：均購于天津市大茂化學試劑廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗原材料檢測

以脹袋變質的低糖腌制韭菜根為供試樣品，參照GB 10468—89，采用酸度計測定樣品pH；參照GB/T 12456—2008，采用酸堿滴定法測定樣品總酸度；參照GB 5009.8—2016，采用酸水解法測定樣品總糖含量；參照GB 2714—2015進行樣品感官檢查。

1.2.2 腐敗菌的菌落分離純化

選取真空包裝后出現腐敗變質的低糖腌制韭菜根，在無菌操作下，稱取25 g，剪碎，放入裝有225 mL無菌生理鹽水的滅菌均質袋中，均質器拍擊均質5 min(拍擊速度為8次/s)，制成樣品勻液，梯度稀釋至適宜濃度，吸取0.1 mL于營養瓊脂培養基上涂布均勻，37 ℃培養24 h，從中挑取典型單菌落并反復進行平板劃線分離，得到純化的單菌落菌株，編號并保存。

1.2.3 優勢腐敗菌的篩選

將分離純化得到的各菌株平板活化12 h，挑起菌體用無菌水制成菌懸液，使菌體濃度約為105～106cfu/mL。將滅菌后的韭菜根浸于菌懸液中，5 s后取出晾干，置于無菌袋中真空包裝，以未接腐敗菌的韭菜根作對照，37 ℃恒溫保存。從是否發生脹袋及韭菜根感官變化方面進行比較，以使韭菜根樣品較快腐敗的接種菌株作為優勢腐敗菌。

1.2.4 優勢腐敗菌的鑒定

采用平板涂布法將各菌株分別接種至營養瓊脂培養基中，37 ℃培養18～24 h后觀察菌落形態，參照《微生物學實驗教程》進行革蘭氏染色和芽孢染色[4]，參照文獻[5]制備細菌掃描電鏡樣品，觀察菌體形態，參照《常見細菌系統鑒定手冊》進行生理生化特性試驗[6]。將各菌株分別接種于肉湯培養基中，37 ℃振蕩培養至對數期，8000 r/min離心收集菌體。按照細菌基因組DNA提取試劑盒方法分離純化菌株基因組DNA。根據原核生物16S rRNA保守序列通用引物：27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492r(5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)，以各菌株的基因組DNA為模板，對該菌株的16S rDNA進行PCR擴增。擴增反應體系(25 μL)：基因組DNA 0.5 μL，10×buffer(with Mg2+) 2.5 μL，引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，Tras DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，加雙蒸H2O至25 μL，反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，測序結果按文獻[7]方法進行分析，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 實驗原材料檢測

以不發生腐敗變質的腌韭菜根為對照，對脹袋變質的腌韭菜根(見圖1)進行總酸、總糖及感官分析檢測，結果見表1。

圖1 腌韭菜根脹袋變質前后對比Fig.1 Comparison of pickled Chinese chives roots before and after bag bulging and deterioration

組別pH總酸(g/100 g)總糖(g/100 g)感官分析對照組6.28～6.440.12～0.1833.06～33.15正常色澤(淡黃色)、辛香氣味、蔥辣味濃、有韌性、飽滿脹袋組4.53～4.670.19～0.2735.23～35.28色澤暗,黑褐色、刺鼻酸敗味、蔥辣味淡、軟焉、不飽滿

由表1可知，真空包裝低糖腌制韭菜根在流通貯藏期間，發生脹袋變質的腌韭菜根酸度、總糖含量均下降，產品的外觀色澤、辛香氣味、質感及口感均發生明顯變化。

2.2 優勢腐敗菌的分離篩選

將腐敗變質的低糖腌制韭菜根均質液通過稀釋涂布及劃線法分離得到17株單菌落，經純化制成菌液，接種至無菌韭菜根中進行致腐實驗，通過脹袋及感官評定比較，發現接種菌株XB3、XB5、XB7、XB8的韭菜根樣品腐敗較快。將這些致腐能力較強的菌株作為優勢菌，進一步研究其形態學特性、生理生化特性及種屬關系。

2.3 優勢腐敗菌的鑒定

2.3.1 優勢腐敗菌的形態及生理生化鑒定

各菌株的掃描電鏡結果見圖2，圖2中的A，B，C，D分別表示菌株XB3、XB5、XB7、XB8。

由圖2可知，XB3菌體呈桿狀，末端鈍圓，菌體表面光滑、無鞭毛、無纖毛，產芽孢；XB5菌體呈短桿狀，末端鈍圓，菌體表面光滑、無鞭毛、無纖毛，產芽孢；XB7菌體呈桿狀或近球狀，菌體表面光滑、無鞭毛、無纖毛，產芽孢；XB8菌體呈長桿狀，菌體表面光滑有內陷、無鞭毛、無纖毛，產芽孢。

圖2 腐敗菌的掃描電鏡照片Fig.2 Scanning electron microsgroph of spoilage bacteria

各株腐敗菌的部分形態學特征和生理生化試驗結果分別見表2和表3。

表2 腐敗菌的形態學特征Table 2 Morphology characteristics of spoilage bacteria

注：“+”表示有；“-”表示沒有。

表3 腐敗菌的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of spoilage bacteria

注：++表示產酸產氣；+-表示產酸不產氣；-+表示不產酸產氣；--表示不產酸不產氣；+表示陽性反應；—表示陰性反應；(+)表示弱陽性反應；(—)表示弱陰性反應。

由表2可知，4株腐敗菌的菌落形態具有明顯差異，均屬于產芽孢桿菌，除XB7外，其余3株菌革蘭氏陽性。由表3可知，所有腐敗菌株接觸酶反應陽性，表明其能產生過氧化氫酶；XB5能液化明膠，表明該菌株具有較強的水解蛋白質的能力；XB3、XB5和XB7表現出甲基紅反應陽性，表明這些菌株可發酵葡萄糖產酸；XB3在葡萄糖、蔗糖發酵中產酸不產氣；XB5在葡萄糖發酵中產酸不產氣，但在蔗糖、乳糖發酵中產酸產氣；XB7在蔗糖發酵中產酸產氣；XB8在葡萄糖發酵中不產酸不產氣，在蔗糖、乳糖發酵中產酸不產氣。分析結果表明，具有產氣能力的菌株可能是引起韭菜根產品脹袋的主要腐敗菌，產酸菌株可能是導致韭菜根酸敗異味的主要腐敗菌，產酶菌株可能會導致韭菜根軟化。

2.3.2 基于16S rRNA基因序列的系統發育分析和分子鑒定

以菌株的總DNA為模板，用細菌16S rRNA序列通用引物進行PCR擴增，其產物電泳結果見圖3。

圖3 腐敗菌的16S rRNA PCR產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 16S rRNA PCR products of spoilage bacteria

1，2，3，4泳道分別表示菌株XB3、XB5、XB7和XB8的16S rRNA基因的PCR擴增產物；MK為DNA Marker。由圖3可知，其序列長度大約在1500 bp。經測序，菌株XB3、XB5、XB7和XB8的序列長度分別為1504，1515，1481，1497 bp，均符合細菌16S rRNA序列長度。將其與數據庫中同源性較高的模式菌株進行比較，構建系統發育進化樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株XB3與Bacilluscereus親緣關系最近，菌株XB5與Bacillusmegaterium親緣關系最近，菌株XB7與Acinetobacterlactucae親緣關系最近，菌株XB8與Paenibacillusamylolyticus親緣關系最近，相似度均大于99%。因此，由分子生物學鑒定結果結合菌落形態特征及生理生化特性可判定，從腐敗韭菜根中分離的腐敗細菌XB3為B.cereus，XB5為B.megaterium，XB7為A.lactucae,XB8為P.amylolyticus。

圖4 基于16S rRNA基因序列同源性的4株腐敗菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic trees of four spoilage bacteria based on 16S rRNA sequence homology

3 結論

微生物生長繁殖是導致真空包裝腌韭菜根脹袋變質的主要原因，脹袋的韭菜根無論是酸度、總糖還是色澤、氣味、口感等感官品質均大大下降。本研究從發生脹袋變質的低糖腌制韭菜根中分離篩選到4株優勢腐敗細菌，經鑒定，主要由B.cereus，B.megaterium，A.lactucae和P.amylolyticus構成。芽孢桿菌是脹袋變質腌韭菜根中的主要腐敗菌屬，其中B.megaterium和A.lactucae可能是引起韭菜根脹袋的主要腐敗菌株，B.megaterium，B.cereus，P.amylolyticus和A.lactucae在一定程度上均能導致韭菜根產生酸敗異味、發黑、軟化等變質現象。該研究有望為解決貴州黔東南州本土特色食品——腌韭菜根在生產和貯藏過程中出現的脹袋變質問題提供參考，也為下一步天然防腐劑的篩選應用及滅菌工藝的優化奠定基礎。