親水作用色譜串聯質譜法測定嬰幼兒乳粉中的牛磺酸

陽 曦,劉 瑋

(綿陽市食品藥品檢驗所,四川綿陽 621000)

牛磺酸又稱β-氨基乙磺酸,最早從牛黃中分離出來,是一種含硫的非蛋白氨基酸,不參與體內蛋白的生物合成。參與人體牛磺酸合成的半胱氨酸亞硫酸羧酶活性較低,因此牛磺酸主要依靠從食物中攝取來滿足機體需要。牛磺酸作為營養活性物質,對人體有著十分重要的生理調節作用,特別是對嬰幼兒的大腦發育、神經傳導、視覺機能的完善和鈣的吸收有良好的作用,能夠增強嬰幼兒免疫力,是嬰幼兒食品至關重要的營養添加劑。缺乏牛磺酸,會對人體造成很多不利的影響[1]。我國國家標準GB14880-2012《食品安全國家標準 食品營養強化劑使用標準》規定，牛磺酸可作為營養強化劑在調制乳粉中使用,GB 10765-2010《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》及GB10767-2010《食品安全國家標準 較大嬰兒和幼兒配方食品》中,對牛磺酸使用的限量值做出了具體要求。可見,測定嬰幼兒乳粉中牛磺酸的含量具有十分重要的意義。

目前,現有的國家標準對食品中牛磺酸的測定主要采用高效液相色譜法[2]。相關文獻報道測定牛磺酸的主要方法有比色法[3]、高效液相色譜法[4-6]、離子色譜法[7]、薄層掃描法[8-9]、氨基酸自動分析法[10-12]、液相色譜-串聯質譜法[13-14]。比色法和薄層掃描法都易受其他氨基酸的干擾,靈敏度和準確度低;高效液相色譜法多采用柱前或柱后衍生測定,樣品前處理過程繁瑣,不能直接對牛磺酸進行測定;離子色譜法普及性較差;氨基酸分析儀測定法所需時間較長,且需要專屬儀器;高效液相色譜-質譜聯用法應用越來越普遍,具有定性準確、靈敏度高、測定時間短等特點。本試驗采用高效液相色譜-質譜聯用法對嬰幼兒乳粉中牛磺酸進行直接測定,省去復雜的前處理過程,建立對嬰幼兒乳粉中牛磺酸含量的直接測定方法,以期能夠快速、準確地對牛磺酸含量進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品:飛鶴、金領冠嬰幼兒乳粉共10批 市售;標準物質:牛磺酸 曼哈格公司;乙腈、甲酸 色譜純,Fisher公司;甲酸銨、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅 分析純,成都市科龍化工試劑廠。

4000 Q TRAP高效液相色譜-串聯質譜儀 美國AB SCIEX公司;離心機 德國eppendorf公司;MS6035電子天平、XSE205電子天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司;Direct-Q超純水機 美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 取試樣2 g,置于50 mL比色管中,加入25 mL水,渦旋混勻后超聲提取(250 W,50 kHz)20 min,再加入0.2 mol/L亞鐵氰化鉀溶液和1 mol/L乙酸鋅溶液各1 mL,混勻,加水定容至刻度。在4 ℃下以8000 r/min離心10 min,取上清液1 mL置于100 mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻,經0.22 μm水系濾膜過濾后,待測定。

1.2.2 親水作用色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒乳粉中牛磺酸的含量

1.2.2.1 液相色譜條件 色譜柱:Poroshell 120 HILIC-Z(2.1×100 mm,2.7 μm);流速:0.4 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:2 μL;流動相A:乙腈,流動相B:10 mmol/L甲酸銨(含0.05%甲酸);梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of liquid chromatography

1.2.2.2 質譜條件 離子源:電噴霧電離源(ESI);掃描方式:負離子掃描;檢測方式:多反應監測(MRM);離子化電壓(IS):-4500 V;離子源溫度(TEM):500 ℃;氣簾氣壓力(CUR):25 psi;噴霧器壓力(GS1):55 psi;輔助加熱器壓力(GS2):50 psi;碰撞器(CAD):Medium;碰撞室入口電壓(EP):-10 V;碰撞室出口電壓(CXP):-14 V;具體參數見表2。

表2 質譜分析參數Table 2 Mass spectrometric analysis parameters

1.2.2.3 質譜條件的優化 選擇合適的母離子、子離子,調節碰撞能量及去簇電壓。

1.2.2.4 色譜柱的選擇 將普通C18和親水作用色譜原理的Poroshell 120 HILIC-Z柱進行比較,選擇保留行為好、靈敏度高、峰型好的色譜柱作為本試驗色譜柱。

1.2.2.5 流動相的優化 比較乙腈-10 mmol/L甲酸銨、乙腈-10 mmol/L甲酸銨(甲酸0.05%)兩種不同的流動相,優化梯度洗脫程序。

1.2.2.6 進樣量的選擇 將2、5、10、20 μL的標準溶液(50 ng/mL)進樣,比較牛磺酸標準物質色譜峰,考察是否有容積效應帶來的影響,選擇合適的進樣量。

1.2.2.7 沉淀方法的選擇 比較固相萃取法和沉淀劑對蛋白質的沉淀效果,采用簡單易行、效果好的沉淀方法。

1.2.2.8 基質效應 本試驗考察樣品經蛋白質沉淀、多倍稀釋、色譜柱的選擇對基質效應的影響。

1.2.2.9 線性關系及檢出限測定 準確稱取牛磺酸標準物質50.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加水溶解并定容至刻度,制成含牛磺酸1 mg/mL的標準儲備液。臨用時,用水稀釋成標準系列溶液,牛磺酸濃度分別為10、20、50、100、200 ng/mL。將標準系列溶液進樣,繪制標準曲線。稀釋標準溶液,以信噪比S/N=3時對應的目標化合物含量作為該方法的檢出限。

1.2.2.10 回收率及精密度實驗 對樣品進行3個水平的加標回收試驗,計算其回收率及精密度。

1.2.3 樣品測定 樣品經前處理后采用1.2.2.1和1.2.2.2的儀器條件,測定市售10批嬰幼兒乳粉中牛磺酸的含量。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

根據牛磺酸的分子結構,采用ESI負離子掃描模式,使用針泵連續進樣,將濃度為1 μg/mL的牛磺酸準儲備液泵入質譜儀,選擇掃描模式為Q1 MS,找到合適的母離子,確定母離子質荷比m/z為124.0。選擇掃描模式為Product lon(MS2),手動調節碰撞能量CE,以5 eV為步長,選擇兩個響應值最強的碎片離子作為子離子。選擇掃描模式為MRM,確定牛磺酸的定性離子對,進一步優化碰撞能量和去簇電壓,得到質譜最佳分析條件,見表2。

2.2 色譜柱的選擇

典型的HILIC流動相是由低水相及高有機相組成,流動相中水是最強的洗脫溶劑,這樣的流動相組成有利于提高電噴霧離子化質譜的靈敏度,同時還可以避免使用離子對試劑。如圖1所示,用200 ng/mL的牛磺酸標準溶液進樣2 μL,圖1a雜峰多,保留性差;圖1b雜峰少,峰型好。牛磺酸具有較強的極性,在普通的C18色譜柱上保留效果較差,而采用Poroshell 120 HILIC-Z色譜柱能有效改善其保留性,且靈敏度提高10倍以上。因此選擇親水作用色譜原理的Poroshell 120 HILIC-Z柱作為分離柱。

圖1 C18色譜柱和Poroshell 120 HILIC-Z柱色譜行為的比較

2.3 流動相的優化

本試驗采用乙腈-10 mmol/L甲酸銨作為流動相。考慮到嬰幼兒乳粉成分比較復雜,可在目標物出峰后適當增加較大比例的水相沖洗步驟,以保護色譜柱。同時,為了使牛磺酸擁有合適的保留時間,且有比較高的離子化效率,因此本試驗采用梯度洗脫程序。在10 mmol/L甲酸銨溶液中加入0.05%的甲酸,有助于改善峰形及提高靈敏度。通過不斷試驗,確定流動相的組成及洗脫程序如表1所示。牛磺酸標準溶液定量離子對的多反應監測MRM圖見圖2。

圖2 牛磺酸標準溶液定量離子對的MRM圖

2.4 進樣量的選擇

由于牛磺酸極易溶于水,難溶于純有機溶劑,為了提高樣品中牛磺酸的提取效率,本試驗采用純水相作為提取溶劑。而試驗所用的Poroshell 120 HILIC-Z柱,是一款具有親水作用的色譜柱,在液相分離模式中,溶劑的洗脫能力由強到弱為:水>甲醇>乙腈。因此,待測樣品溶液由于水作為溶劑,會造成比較強的溶劑效應。當進樣溶劑與流動相混合時,由于樣品溶液的溶劑強度強于流動相溶劑強度,部分樣品會先被洗脫流出色譜柱,使組分峰表現出峰的前伸、峰展寬、峰分叉等現象。在不改變樣品提取溶劑及流動相的情況下,減少進樣體積能夠降低溶劑效應的影響。本試驗對50 ng/mL的牛磺酸標準溶液進樣,比較了進樣體積為2、5、10、20 μL的譜圖,如圖3所示,結果表明:進樣體積為5、10、20 μL時均造成了峰的變形,進樣體積為2 μL時展現出良好的峰形,故本試驗選擇進樣體積為2 μL。

圖3 牛磺酸標準溶液不同進樣體積的MRM圖

2.5 沉淀方法的選擇

乳粉中含有大量的蛋白質,所以在樣品前處理時要先除去樣品中的蛋白質。常用的除去蛋白質的方法有固相萃取法[15]和蛋白沉淀法[16]。固相萃取法具有凈化效率高的優點,但處理過程較為繁瑣且成本較高。蛋白沉淀法通過添加沉淀劑來達到凈化的效果,操作簡便快捷。本試驗選擇亞鐵氰化鉀和乙酸鋅的混合溶液作為沉淀劑進行樣品處理,能夠取得滿意的凈化效果及回收率。

2.6 基質效應

基質是樣品中被測物以外的組分,會對被測物的檢測造成一定的干擾,表現為離子抑制和離子增強兩種形式,一般而言,離子抑制現象更容易發生[17]。基質效應會對檢測結果的準確度造成影響,嚴重干擾了樣品的定量分析,因此,在利用高效液相色譜法-串聯質譜法分析樣品時,應對基質效應進行評估。消除和減少基質效應的影響,能確保數據的準確性。消除基質效應常用的方法有:使用合適的內標、選擇合適的前處理方法、選擇合適的色譜及質譜條件等。

嬰幼兒乳粉中牛磺酸的添加量一般較高,因此待測樣品溶液一般需進行多倍稀釋才能在測定線性范圍內。試驗考察了3種嬰幼兒乳粉的基質效應,提取好后的待測樣品溶液均需稀釋100倍之后才能進樣,結果表明,稀釋后并無基質效應產生。本試驗采用的親水作用色譜柱是一種以極性材料為固定相,高比例有機相為流動相的色譜柱,保留時間隨極性的增強而增加。樣品處理經沉淀蛋白質后,能夠減少部分基質帶來的影響,但是樣品中的脂肪類物質并沒有被去除,采用HILIC色譜柱進行測定,脂肪類物質不被色譜柱所保留,從而有效地除去了基質效應的影響。因此,本試驗從樣品的前處理、色譜柱的選擇、稀釋待測樣品等幾個方面消除了基質帶來的干擾。

2.7 線性關系及檢出限

對牛磺酸標準系列溶液進行測定,繪制標準曲線,以信噪比S/N=3時對應的目標化合物含量作為該方法的檢出限,結果見表3。結果表明,牛磺酸標準品線性關系良好,相關系數為0.9997,檢出限為0.04 mg/kg。

表3 牛磺酸標準品的線性范圍、回歸方程、相關系數及檢出限Table 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients and LODs of taurine standard

2.8 回收率及精密度

按試驗方法對樣品進行3個水平的加標回收試驗(n=6),加標水平及結果見表4。結果表明,牛磺酸回收率為81.2～90.5%,相對標準偏差小于4.0%,該方法具有良好的準確度和重復性。

表4 回收試驗結果(n=6)Table 4 Results of recovery test(n=6)

2.9 樣品的測定

采用所建立的方法對市售10批嬰幼兒乳粉樣品進行檢測,結果表明,牛磺酸的含量與樣品標示值(380 mg/100 g)基本一致,且符合國家限量要求。測定結果見表5。

表5 樣品中牛磺酸含量Table 5 Taurine content in samples

3 結論

本試驗建立了嬰幼兒乳粉中牛磺酸的HILIC-MS/MS檢測方法,樣品經提取后,采用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑,選用Poroshell 120 HILIC-Z親水作用色譜柱,用乙腈-10 mmol/L甲酸銨(甲酸0.05%)作為流動相進行梯度洗脫,質譜在負離子模式下采用MRM多反應監測,牛磺酸在10～200 ng/mL濃度范圍線性關系良好,相關系數r為0.9997,檢出限為0.04 mg/kg,回收率在81.2～90.5%之間,相對標準偏差小于4.0%。該方法快速、準確、靈敏度高、檢出限低,可有效滿足對嬰幼兒乳粉中牛磺酸含量的直接測定。