蝦青素介導(dǎo)Nrf2信號(hào)通路減輕大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡

胡 戈,曹建民,周海濤,郭 嫻,*,汪 毅,牛衍龍,任 奕,李 倩

(1.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院,北京 100084;2.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院,北京 100023;3.北京聯(lián)合大學(xué),生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191;4.贛南醫(yī)學(xué)院康復(fù)學(xué)院,江西贛州 341000)

蝦青素是一類類胡蘿卜素,因其結(jié)構(gòu)末端的不飽和羥酮基可為活性氧和自由基提供電子,從而起到清除自由基的作用,所以被稱作自然界的“超級(jí)抗氧化劑”[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證實(shí),蝦青素能夠用于抗氧化應(yīng)激、抑炎、抗腫瘤、改善動(dòng)脈粥樣硬化等[2-3]。長(zhǎng)時(shí)間的大強(qiáng)度訓(xùn)練可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生缺血缺氧反應(yīng)誘發(fā)活性氧的生成量增多。心肌是由心肌細(xì)胞構(gòu)成的一種肌肉組織,通過(guò)自主節(jié)律性地收縮和舒張,運(yùn)送血液至全身的各系統(tǒng)和器官,是耗氧量極高的組織。心肌同時(shí)含有約為骨骼肌10倍豐富的毛細(xì)血管網(wǎng),且肌細(xì)胞中存在大量的線粒體,這也進(jìn)一步增加了心肌細(xì)胞旺盛的有氧代謝。心臟作為缺血缺氧反應(yīng)的敏感器官,在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后,心肌細(xì)胞受到機(jī)械牽引力和容量負(fù)荷增加,極易造成缺氧缺血損傷,臨床表現(xiàn)為血清肌鈣蛋白含量持續(xù)升高[4-5]。心肌細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞程序性死亡的重要過(guò)程。大強(qiáng)度訓(xùn)練造成的機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高可引發(fā)心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷增強(qiáng)。為了維持心臟的正常形態(tài)和結(jié)構(gòu),心肌細(xì)胞的凋亡水平也會(huì)相應(yīng)增加[6]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)是心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵信號(hào)通路,它可與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)進(jìn)行識(shí)別后結(jié)合,調(diào)節(jié)下游血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等抗氧化酶的基因表達(dá),進(jìn)而降低各種氧化應(yīng)激反應(yīng)。

目前,關(guān)于蝦青素對(duì)心肌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用的相關(guān)研究較少。研究表明,蝦青素可猝滅運(yùn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧,減少心肌細(xì)胞DNA鏈的斷裂和線粒體的損傷,進(jìn)而降低凋亡水平減少細(xì)胞損傷[7]。也有研究表明[8-9],過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率升高可通過(guò)蝦青素進(jìn)行干預(yù),從而降低凋亡率,上調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因2(B cell lymphoma/leukemia 2,Bcl2)/Bcl2相關(guān)x蛋白(Bcl2 associated x protein,Bax)的比值,使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的活性被抑制,而這種良性改變呈現(xiàn)濃度的劑量效應(yīng)。Nrf2是否為蝦青素發(fā)揮運(yùn)動(dòng)造成的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵信號(hào)通路也未有研究證實(shí)。因此,本研究采用蝦青素在6周大強(qiáng)度訓(xùn)練期間對(duì)大鼠進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù),觀察大鼠過(guò)度訓(xùn)練后補(bǔ)充蝦青素對(duì)其心肌細(xì)胞凋亡水平和抗氧化能力的變化,研究蝦青素能否介導(dǎo)Nrf2信號(hào)通路,抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,從而為蝦青素的研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦青素 純度>95%,Santa cruz Biotechnology公司;食用大豆油 益海嘉里食品營(yíng)銷有限公司;cTNI酶聯(lián)免疫試劑盒、T-AOC酶聯(lián)免疫試劑盒、SOD酶聯(lián)免疫試劑盒、MDA酶聯(lián)免疫試劑盒 美國(guó)BD公司;TUNEL心肌細(xì)胞凋亡測(cè)試試劑盒 瑞士Roche公司;Nrf2、HO-1、Bax和Bcl2的一抗、二抗和DAB顯色劑 Servicebio試劑公司;SPF級(jí)雄性SD大鼠40只 體重(202.41±9.52) g,7周齡,中華人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物生產(chǎn)合格證編號(hào)SCXK(軍)2012-0004)。

Pannoramic MIDI組織切片掃描儀、Pannoramic viewer軟件、Quant center分析軟件 匈牙利3D HISTECH公司;Mutiscan GO酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司;SIGMA 3K15高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司;DY89-2玻璃勻漿器 寧波新芝生物科技有限公司;TDL-4離心機(jī) 中國(guó)飛鴿科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 大鼠在北京體育大學(xué)動(dòng)物房進(jìn)行4 d的適應(yīng)性喂養(yǎng),以10 m/min,坡度0 °,10 min/d的運(yùn)動(dòng)量進(jìn)行篩選,以剔除不能完成運(yùn)動(dòng)/運(yùn)動(dòng)能力較差的大鼠,按照數(shù)字隨機(jī)分組法,將40只大鼠隨機(jī)分為3組:安靜對(duì)照組(C組,10只)、大強(qiáng)度訓(xùn)練組(HT組,15只)和蝦青素+大強(qiáng)度訓(xùn)練組(HTA組,15只)。HT組、HTA組大鼠因訓(xùn)練中夾尾、驅(qū)趕訓(xùn)練,訓(xùn)練強(qiáng)度過(guò)大及疲勞無(wú)法及時(shí)恢復(fù)等原因,導(dǎo)致部分大鼠死亡,最終HT組剩余12只大鼠,HTA組剩余13只大鼠,C組大鼠數(shù)量不變。

1.2.2 訓(xùn)練和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充方案 C組進(jìn)行普通飼養(yǎng)不進(jìn)行任何干預(yù),HT和HTA組進(jìn)行6周遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練,訓(xùn)練方案見(jiàn)表1。第2周訓(xùn)練開(kāi)始,每次從10 m/min開(kāi)始,每5 min速度增加5 m/min,直至本周目標(biāo)強(qiáng)度。最后一周大鼠若無(wú)法維持強(qiáng)度,運(yùn)動(dòng)至力竭。運(yùn)動(dòng)干預(yù)期間,HTA組每天訓(xùn)練后進(jìn)行1次灌胃蝦青素,蝦青素配合食用大豆油溶劑,濃度為4 mg/mL,灌胃劑量為20 mg/kg/d(查閱文獻(xiàn)[10-11]及預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得最佳劑量),灌胃體積為5 mL/kg,C組和HT組灌胃5 mL/kg食用大豆油,灌胃共持續(xù)6周。

表1 大鼠訓(xùn)練方案Table 1 Training program of rats

1.2.3 樣本采集 第6周最后1次訓(xùn)練結(jié)束后24 h處死大鼠。2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠,腹總動(dòng)脈取血5 mL并放入促凝管中,靜置2 h待血清和血細(xì)胞分離后,將其放入4 ℃的低溫離心機(jī)進(jìn)行3000 r/min離心15 min,取上層血清分裝后置-20 ℃冰箱中保存待查。左心室心肌組織剪成小塊后稱取重量,按照組織重量/體積1∶9的比例置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污,隨后充分研磨制成10%的心肌組織勻漿液,5000 r/min離心5 min,取上層清液待測(cè)。同時(shí),另取部分左心室心肌組織浸入多聚甲醛固定液中固定,并用石蠟包埋制備石蠟切片,嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒的相關(guān)方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 將心臟從固定液中取出,流水洗滌12 h,梯度酒精脫水后透明,石蠟包埋,制成石蠟切片。將組織切片上機(jī)在掃描儀的鏡頭下逐步移動(dòng),邊移動(dòng)邊成像,進(jìn)而將組織切片上所有的組織信息都掃描成像。用Pannoramic viewer軟件打開(kāi)后進(jìn)行400倍放大,并截取任意部位圖片,掃描完成后進(jìn)入Quant center分析軟件自動(dòng)識(shí)別,切片上所有的深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性,棕黃色為中度陽(yáng)性,淺黃色為弱陽(yáng)性,藍(lán)色細(xì)胞核為陰性。進(jìn)而對(duì)每個(gè)組織點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別分析出強(qiáng)陽(yáng)性、中度陽(yáng)性、弱陽(yáng)性及陰性的面積(單位:像素),陽(yáng)性的百分比,最后進(jìn)行H-score評(píng)分,從而對(duì)其進(jìn)行半定量分析。細(xì)胞凋亡指數(shù)H-score=(弱陽(yáng)性細(xì)胞密度×1)+(中陽(yáng)性細(xì)胞密度×2)+(強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞密度×3)。

1.2.4.2 心肌Nrf2、HO-1、Bcl2和Bax的表達(dá)量 將心臟從固定液中取出,流水洗滌12 h,梯度酒精脫水后透明,石蠟包埋,制成切片。隨后將制好的石蠟切片脫蠟水化后進(jìn)行抗原修復(fù),避光、室溫孵育25 min,脫色洗滌3次后進(jìn)行血清封閉,封閉后加入一抗、二抗進(jìn)行DAB顯色,顯色終止隨后脫水封片。于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400),每個(gè)視野隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并得平均值,按照著色深淺對(duì)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分級(jí):無(wú)著色為陰性,黃色為弱陽(yáng)性,棕色為中陽(yáng)性,棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性。按照著色強(qiáng)度和著色范圍用H-socre方法進(jìn)行半定量分析[12],H-score公式計(jì)算如下:H-socre=3×強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量百分比+2×中度陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量百分比+l×弱陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量百分比。

1.2.4.3 血清肌鈣蛋白I(Cardiac Troponin I,cTNI)、心肌總抗氧化能力(Total antioxidative capacity,T-AOC)、SOD活性和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)濃度 將分裝后的各組大鼠的血清按照試劑盒的相關(guān)步驟,采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)使用Mutiscan GO酶標(biāo)儀進(jìn)行cTNI測(cè)試。心肌T-AOC、SOD活性和MDA濃度的測(cè)定:取心肌組織勻漿的上清液,按照試劑盒的相關(guān)步驟,采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)使用Mutiscan GO酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大鼠血清cTNI濃度的變化

cTNI是一種以游離形式或結(jié)合形式僅存在于心肌細(xì)胞中的收縮調(diào)節(jié)蛋白,機(jī)體處于正常時(shí)，血中該蛋白含量很低,但心肌細(xì)胞缺血缺氧損傷時(shí),可造成細(xì)胞的通透性發(fā)生改變,從而使cTNI大量分泌入血,所以該物質(zhì)已被公認(rèn)為可用于診斷心肌損傷的敏感標(biāo)志物。本研究的結(jié)果顯示(表2),與C組比較,HT組血清cTNI水平極顯著性升高(p<0.01)。通過(guò)6周的蝦青素干預(yù)后,與HT組比較,HTA組血清cTNI水平顯著性降低(p<0.05)。研究表明[13-14],長(zhǎng)時(shí)間的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成心肌供血不足,引起缺血缺氧反應(yīng),此時(shí)心肌細(xì)胞濾過(guò)的cTNI造成血清含量的升高不僅可在運(yùn)動(dòng)后即刻出現(xiàn),甚至可維持到運(yùn)動(dòng)后24 h。本研究也得到了類似的結(jié)果,表明該運(yùn)動(dòng)負(fù)荷確實(shí)導(dǎo)致了心肌的缺血損傷,而通過(guò)蝦青素的補(bǔ)充,緩解了心肌的缺血損傷。

表2 各組大鼠血清cTNITable 2 Serum cTNI in each group of rats

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

心肌細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞程序性死亡的重要過(guò)程,而在長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后,缺血缺氧刺激造成的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高,進(jìn)而造成心肌細(xì)胞凋亡水平升高。TUNEL染色結(jié)果顯示(表3),與C組比較,HT組和HTA組心肌細(xì)胞凋亡H-score極顯著性升高(p<0.01)。通過(guò)6周的蝦青素干預(yù)后,與HT組比較,HTA組心肌細(xì)胞凋亡H-score極顯著性降低(p<0.01)。表明大強(qiáng)度訓(xùn)練造成了心肌細(xì)胞凋亡水平升高,而通過(guò)6周的蝦青素干預(yù)可下調(diào)心肌細(xì)胞凋亡水平,但仍然未降低至正常水平。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡H-scoreTable 3 H-score of myocardial apoptosis in each group of rats

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl2表達(dá)的變化

抗凋亡蛋白Bcl2和促凋亡蛋白Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的Bcl2蛋白家族的重要成員,Bcl2/Bax的比值與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。從凋亡蛋白表達(dá)變化情況結(jié)果可知(表4),促凋亡蛋白Bax在HT組的表達(dá)較C組呈現(xiàn)極顯著升高(p<0.01),補(bǔ)充蝦青素后,HTA組較HT組Bax的表達(dá)呈現(xiàn)極顯著性下降(p<0.01),但仍較C組顯著性升高(p<0.05)。抑制凋亡蛋白Bcl2在HT組的表達(dá)較C組雖有下降,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。HTA組較HT組的Bcl2表達(dá)呈現(xiàn)極顯著性升高(p<0.01)。通過(guò)對(duì)Bcl2/Bax的分析后發(fā)現(xiàn),HT組較C組呈現(xiàn)極顯著性下降(p<0.01),而HTA組較HT組呈現(xiàn)極顯著性升高(p<0.01),同時(shí)HTA組較C組呈現(xiàn)極顯著性升高(p<0.01)。運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生程度與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度具有重要的劑量效應(yīng)關(guān)系[14],即運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度越大,心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率越高,表現(xiàn)為抗凋亡蛋白Bcl2和促凋亡蛋白Bax表達(dá)的變化。本研究的結(jié)果表明,6周的大強(qiáng)度訓(xùn)練使大鼠的心肌細(xì)胞凋亡水平增強(qiáng),表現(xiàn)為抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)上升和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)下降,通過(guò)6周的蝦青素干預(yù)后,下調(diào)了大鼠心肌的凋亡水平,表現(xiàn)為抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)下降和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上升。

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax 和Bcl-2 H-score結(jié)果Table 4 H-score of Bcl2 and Bax in myocardium in each group of rats

2.4 各組大鼠心肌組織的Nrf2和HO-1的表達(dá)變化

Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子,受Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)的調(diào)控,通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件ARE相互作用,調(diào)節(jié)多種抗氧化蛋白的表達(dá)。Nrf2通路被激活后,可導(dǎo)致多種細(xì)胞的凋亡反應(yīng)變化。從各組大鼠心肌組織Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)變化H-score可知(表5),HT組的心肌組織中的Nrf2表達(dá)較C組無(wú)顯著差異(p>0.05),但HO-1的表達(dá)較C組呈現(xiàn)顯著下降(p<0.05)。經(jīng)過(guò)6周的蝦青素干預(yù)后,HTA組的Nrf2較HT組呈現(xiàn)極顯著性升高(p<0.01),同時(shí)HO-1的表達(dá)顯著性上升(p<0.05)。可能的原因在于,當(dāng)機(jī)體遭受活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的攻擊時(shí),通過(guò)Nrf2-ARE通路的調(diào)控,抑制Nrf2的泛素化,使抗氧化元件ARE及其保護(hù)性蛋白合成被激活。而補(bǔ)充蝦青素,可通過(guò)促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位,從而促進(jìn)Nrf2-ARE通路下游的解毒酶的表達(dá),進(jìn)而降低ROS的損傷,降低氧化應(yīng)激,調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞損傷[15],所以本研究表明,大強(qiáng)度訓(xùn)練后HO-1蛋白表達(dá)下降,蝦青素干預(yù)后,Nrf2通路激活,HO-1蛋白表達(dá)上升。

表5 各組大鼠心肌組織Nrf2 和HO-1蛋白表達(dá)H-score結(jié)果Table 5 H-score of Nrf2 and HO-1 in myocardium in each group of rats

2.5 各組大鼠心肌組織的SOD、T-AOC活性和MDA濃度的變化

Nrf2與抗氧化元件ARE結(jié)合后,可以啟動(dòng)其下游的過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、SOD等多種保護(hù)基因的表達(dá),減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),從而提高細(xì)胞及組織的抗氧化、抗炎、抗凋亡能力。從各組大鼠心肌組織的相關(guān)抗氧化酶的活性和濃度變化可知(表6),HT組的SOD、T-AOC的活性均較C組呈現(xiàn)極顯著性降低(p<0.01),同時(shí)MDA的濃度較C組呈現(xiàn)極顯著性升高(p<0.01)。經(jīng)過(guò)6周的蝦青素干預(yù)后,HTA組的SOD、T-AOC的活性均較HT組呈現(xiàn)極顯著性升高(p<0.01),同時(shí)MDA的濃度呈現(xiàn)顯著性下降(p<0.05),但與C組相比仍存在顯著性差異(p<0.01),未恢復(fù)到安靜水平。由此說(shuō)明,本研究的大強(qiáng)度訓(xùn)練誘發(fā)ROS產(chǎn)生增多,機(jī)體不能及時(shí)清除運(yùn)動(dòng)應(yīng)激產(chǎn)生的ROS,導(dǎo)致心肌抗氧化狀態(tài)失衡,通過(guò)蝦青素的補(bǔ)充后,激活了Nrf2通路,促進(jìn)了抗氧化酶活性的增強(qiáng),進(jìn)而改善了心肌的氧化應(yīng)激水平。

表6 各組大鼠心肌組織的SOD、 T-AOC活性和MDA的濃度結(jié)果Table 6 T-AOC,SOD activity and MDA concentration in myocardium in each group of rats

3 討論

當(dāng)機(jī)體進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí),心肌收縮力增強(qiáng),心率加快,加速了它在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的氧耗量。同時(shí)由于冠狀動(dòng)脈不能滿足心肌增加的供血需求,導(dǎo)致心肌相對(duì)缺血,此時(shí)恒定耗氧率與心肌氧供需求間出現(xiàn)失衡狀態(tài),進(jìn)一步造成心肌缺氧[16]。研究表明[17-18],長(zhǎng)時(shí)間的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成心肌供血不足,引起缺血缺氧反應(yīng),此時(shí)心肌細(xì)胞濾過(guò)的cTNI造成血清含量的升高不僅可在運(yùn)動(dòng)后即刻出現(xiàn),甚至可維持到運(yùn)動(dòng)后24 h。所以在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,cTNI也可作為反映運(yùn)動(dòng)負(fù)荷是否造成心肌缺血損傷的重要依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)6周的大強(qiáng)度訓(xùn)練干預(yù)后,HT組血清cTNI較C組顯著升高,表明該運(yùn)動(dòng)負(fù)荷導(dǎo)致了心肌的缺血損傷。

心肌細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞主動(dòng)、積極程序性死亡的重要過(guò)程-即心肌細(xì)胞的自殺行為。在長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后,運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌細(xì)胞造成的機(jī)械性牽拉可激活細(xì)胞凋亡,同時(shí)運(yùn)動(dòng)過(guò)程的缺血缺氧刺激也可造成心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高,進(jìn)而造成心肌細(xì)胞凋亡水平升高,表現(xiàn)為抗凋亡蛋白Bcl2和促凋亡蛋白Bax表達(dá)的變化。王瑜娟[19]研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生程度與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度具有重要的劑量效應(yīng)關(guān)系,即運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度越大,心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率越高。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子,它受Keap1的調(diào)控,同時(shí)與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合,調(diào)節(jié)下游的SOD、HO-1等多種抗氧化蛋白的表達(dá),進(jìn)而抵抗各種氧化應(yīng)激[20]。研究表明[20-21],非運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下,胞漿中的Nrf2可與Keap1形成二聚體抑制組織或血中的Nrf2表達(dá)高水平。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生大量的ROS攻擊Nrf2,使Keap1的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,加速解偶聯(lián)作用,進(jìn)而刺激少量Nrf2從胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,導(dǎo)致胞核的Nrf2蛋白表達(dá)升高,進(jìn)行調(diào)控多種抗氧化酶的表達(dá),包括CAT、SOD、HO-1等,發(fā)揮清除自由基的作用。當(dāng)Nrf2缺失時(shí),這些酶的表達(dá)受到嚴(yán)重影響,機(jī)體的抗氧化能力也大大削弱。Nrf2通路被激活后,還可導(dǎo)致多種細(xì)胞的凋亡反應(yīng)變化。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究者的研究表明[22-23],抑制Nrf2信號(hào)途徑可降低缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡水平,改善心肌損傷。國(guó)外的研究也表明[24-25],活性氧增高導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷和凋亡水平升高可通過(guò)激活Nrf2通路進(jìn)行保護(hù),進(jìn)而下調(diào)凋亡水平。

本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn),持續(xù)6周的大強(qiáng)度訓(xùn)練的HT組心肌細(xì)胞凋亡率和Bax的表達(dá)均較C組極顯著升高(p<0.01),而B(niǎo)cl2/Bax的比值極顯著降低(p<0.01),說(shuō)明該訓(xùn)練造成大鼠心肌缺血缺氧反應(yīng),進(jìn)而致心肌細(xì)胞凋亡水平增強(qiáng)。與C組相比,HT組心肌組織Nrf2水平無(wú)顯著變化(p>0.05),但其下游的HO-1的蛋白表達(dá)水平、抗氧化酶SOD和T-AOC的活性均顯著低于對(duì)照組(p<0.05),與此同時(shí),MDA含量極顯著性升高(p<0.01)。說(shuō)明本研究的長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),大量自由基生成增多而清除不及時(shí),一定程度抑制了Nrf2通路發(fā)揮抗氧化作用,但由于Nrf2不能正常編碼抗氧化酶類蛋白,此時(shí)表現(xiàn)為抗氧化酶SOD和T-AOC的活性有所降低,同時(shí)HO-1的蛋白表達(dá)量降低,而MDA含量升高,機(jī)體抗氧化能力受損,也進(jìn)一步加重了心肌細(xì)胞凋亡。

6周的蝦青素干預(yù)后,HTA組cTNI較HT組呈現(xiàn)顯著性下降(p<0.05),同時(shí)Bax的表達(dá)極顯著性下降(p<0.01),而B(niǎo)cl2的表達(dá)和Bcl2/Bax的比值極顯著性升高(p<0.01),說(shuō)明6周的蝦青素干預(yù)有效地下調(diào)了大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心肌凋亡水平升高,進(jìn)而減輕了心肌的微細(xì)損傷。與此同時(shí),HTA組心肌組織Nrf2表達(dá)、HO-1的表達(dá)、SOD和T-AOC抗氧化酶的活性較HT組進(jìn)一步明顯升高,MDA含量下降。國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致致線粒體的ROS生成增多,補(bǔ)充蝦青素可減少線粒體的ROS生成,并進(jìn)一步減少DNA鏈的斷裂和線粒體的損傷,從而維持線粒體的膜電位保護(hù)線粒體功能,進(jìn)而減少細(xì)胞的凋亡水平[26]。也有研究發(fā)現(xiàn),蝦青素可通過(guò)調(diào)節(jié)ROS依賴的內(nèi)源性凋亡途徑,抑制細(xì)胞色素C的釋放,進(jìn)而下調(diào)Bax的表達(dá),上調(diào)Bcl2的表達(dá)抑制心肌細(xì)胞的凋亡水平[27]。因此,大強(qiáng)度訓(xùn)練后進(jìn)行蝦青素的持續(xù)補(bǔ)充,能調(diào)控Nrf2-ARE信號(hào)通路,下調(diào)胞核的Nrf2蛋白表達(dá),啟動(dòng)下游SOD、HO-1等多種抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄,提高SOD和T-AOC抗氧化酶的活性,減少心肌細(xì)胞受自由基攻擊損傷[9,11]。

4 結(jié)論

6周的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可造成心肌供血不足,引起缺血缺氧反應(yīng),加劇心肌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而引起心肌損傷,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的Bax和Bcl2蛋白的表達(dá)變化,抗氧化酶SOD和T-AOC活性下降。6周的蝦青素補(bǔ)充介導(dǎo)Nrf2通路上調(diào)Nrf2和HO-1表達(dá),提高SOD和T-AOC抗氧化酶的活性,降低心肌細(xì)胞凋亡水平,減少促凋亡蛋白Bax的蛋白表達(dá),增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(dá),抑制和緩解運(yùn)動(dòng)性心肌損傷,保持心臟組織結(jié)構(gòu)和正常功能。