速凍的微觀世界

楊先碧

自古以來，人類的好奇心不斷地推動著社會進步。在好奇心的驅使下，人類不僅把目光投向數萬光年之外的星空，也把視野推進到微納尺寸的微觀世界。對生命的細節看得越仔細，就越有利于人們知曉生命的本質。正是在這樣的背景下，顯微技術成為熱門的科研領域，相關科學家也多次榮獲諾貝爾獎。瑞士科學家雅克·杜波謝、美國科學家阿希姆·弗蘭克、英國科學家理查德·亨德森，也因在冷凍顯微電鏡領域的突出貢獻，而分享了2017年諾貝爾化學獎。

顯微鏡放大微小樣品

如何看清微觀世界里的小東西？我們首先想到的就是使用顯微鏡。原始的光學顯微鏡是一個高倍率的放大鏡。據記載，在1610年前，意大利物理學家伽利略己制作過復式顯微鏡，并觀察了昆蟲的復眼。這是一種己具目鏡、物鏡和鏡簡等裝置，并被固定在支架上的顯微鏡。

1665年前后，英國生物學家胡克發明了比較類似我們現在學校實驗室里用的顯微鏡，并通過這臺顯微鏡看到了軟木中網格狀的結構，胡克稱之為“細胞”。這是人類歷史上最偉大的發現之一，大大推動了生物學的發展。

與胡克同時代的荷蘭科學家列文虎克對顯微技術的推動做出了主要貢獻。他一生制作了不少于247架顯微鏡，觀察了許多細菌、原生動物和動植物組織，是第一個用顯微鏡做科學觀察的人。到18世紀，顯微鏡已有許多改進，應用比較普遍，已作為一種商品進行生產。

然而，傳統的光學顯微鏡不能無限制地放大微小的樣品，它會受到“阿貝原則”的限制。什么是“阿貝原則”？1873年，德國顯微鏡學家恩斯特·阿貝通過計算發現，由于光波相互干擾的原因，光學顯微鏡不能無限度地放大微小樣品，最多只能“看到”光波波長一半的樣品，即尺寸不小于200納米的樣品。這就是有名的“阿貝原則”，200納米也被稱為光學顯微鏡的“繞射極限”。

如何看清生物大分子

光學顯微鏡只能看到細胞或細胞內較大的細胞器，要看到100納米以下的生物大分子就不太可能了。生物大分子是指生物體細胞內存在的蛋白質、核酸、多糖等大分子。每個生物大分子內有幾千到幾十萬個原子，分子量從幾萬到幾百萬以上。生物大分子的結構很復雜，但其基本的結構單元并不復雜。蛋白質分子是由氨基酸分子以一定的順序排列成的長鏈。氨基酸分子是大部分生命物質的組成材料，不同的氨基酸分子有好幾十種。生物體內的絕大多數酶就屬于蛋白質，是生物體維持正常代謝功能所不可缺少的。

為了突破光學顯微鏡的局限，弄清楚生物大分子的構造，科學家想了很多辦法。有的科學家制造出超高分辨率光學顯微鏡，其實是讓生物分子發熒光，這種方法的使用有一些局限性。因為它是用激光來激發生物大分子，這樣照射時間不能太長，否則可能殺死生物大分子。但是，照射時間短又可能會失去一些重要信息。而且，超高分辨率光學顯微鏡最高只能達到10納米的分辨率，仍然無法看清分子內部的精細結構。

還有一種很常用的方法是“x射線晶體衍射”技術。之前，亨德森就非常喜歡用這種技術來研究生物大分子。但是，這種技術也有很明顯的局限性，那就是這種方法需要首先獲取純度很高的生物大分子晶體。而不少生物大分子結晶情況不理想，甚至有的就不能結晶。膜蛋白就是一個很大的挑戰。對于大多數的生物，膜蛋白占了蛋白質組的20%～30%，藥物靶點的達到40%以上。然而，這些分子的結構很少能通過X射線晶體學來闡明。

科學家還想到的方法是用電子顯微鏡（簡稱電鏡）。電鏡的分辨率的確很高，可以達到納米級以下，看清生物大分子是沒啥問題了。電子的波長是光子波長的十萬分之一左右，就像一根極細的探針，理論上它打在蛋白質分子等生物大分子身上能被反射，這些反射的電子就能產生一張照片，這就是電鏡的基本原理。這也是電鏡能比光學顯微鏡分辨率高得多的原因。

起初，電鏡是在材料科學領域中使用的，主要是用其高分辨率來解析材料的結構。電鏡在材料科學上的應用遙遙領先于在生命科學上的應用。直到1947～1961年，生物學家才借鑒材料科學中的重金屬染色技術，利用電鏡技術觀測到了許多細胞亞顯微結構，如葉綠體、線粒體、核糖體，等等。然而，電鏡的局限性也很明顯，那就是不能看到活生生的生物大分子。因為電鏡需要在高真空條件下工作，而生物樣品的含水量很高，水分的揮發使整個樣品無法保持真空。另外，電鏡的電子攜帶的能量很高，會把細胞“殘忍地燒死”。這樣一來，生物學家就難以研究分子在活細胞中的正常活動。

速凍凝固生命細節

為了讓電鏡也能看到活細胞內的生物分子，科學家想了很多辦法。最終想到的辦法就是速凍。這就好比科幻小說中的冷凍休眠，把活人速凍之后，人體組織和細胞進入幾乎沒有活動的休眠狀態。多年以后，采用合理的方法解凍，人體又活過來了。也就是說，速凍的細胞雖然幾乎不能活動，但是它們的的確確具有生物活性。

在冷凍電鏡中，生物大分子被迅速冷凍，使得標本內部和周圍的水被固定為玻璃態，以防止晶體的形成。玻璃態——一種看上去是固體，但其分子排列是無序的形態，所以是不折不扣的流體。為什么是玻璃態而不是冰（晶體）呢？首先，是為了保護生物大分子，凍成冰有可能讓生物大分子發生脫水，冰晶也容易傷害生物。其次，冰會衍射電子，從而降低電鏡觀察的圖像質量。

利用電鏡向冷凍樣本發射電子束，被玻璃態速凍水包裹的生物大分子處于“休眠狀態”，不再怕電鏡的真空環境，也不怕高能電子來“燒”它。散射后的電子通過一個鏡頭形成二維且放大的圖像，并記錄在檢測器上。結合從各個角度拍攝的圖像并取這些角度的平均值，可以生成生物大分子結構的3D模型。

最早發明冷凍電鏡的是亨德森，當時他用X射線晶體衍射技術研究膜蛋白遇到了困境，因為如上文所說，膜蛋白不能結晶。他用液氮冷凍的方法來保護視紫紅質蛋白（一種膜蛋白）樣品不被電子束摧毀。終于在1975年，第一個非常粗糙的視紫紅質蛋白結構發表了出來，圖片上可以看出七個跨膜蛋白鏈。

不過，亨德森所發明的速凍技術比較粗糙，獲得的圖像也非常模糊。速凍，聽起來好像是一件非常容易的事情，不就是快速冷卻么？然而，科學家探索了很久才找到合理的方法。1982年，杜波謝找到了一種快速冷凍的方法，使水分子還來不及變成排列整齊的冰晶就被凍成像玻璃一樣的物質。

杜波謝發現，雖然水被冷凍之后極易形成冰晶，如六角形的晶體或者立方晶體，但當水被十分迅速地冷凍時（冷凍速度約2.6x105℃/秒），就不會形成晶體，而成為無定形的冰（即“玻璃態”）。將溶液中的生物大分子速凍在玻璃態的水中，就可以在液氮溫度下使用電鏡進行觀察。這奠定了冷凍電鏡制樣與觀察的基本技術手段，標志著冷凍電鏡技術的誕生。

不過，杜波謝的冷凍電鏡獲得的圖像的細節還不是很豐富，那些生物分子在照片中都是難以名狀的一團團的物體，這一領域的研究者也被戲稱為“難以名狀學家”（blobologist）。況且，電鏡獲得的都是二維圖像，難以確定生物大分子的三維結構。

1986年，弗蘭克找到了合適的解決辦法。弗蘭克采用的方法是“同向拼圖”。他對同一種生物大分子不停地拍照，拍上數萬張甚至幾十萬張。聽起來似乎有些嚇人，但是對自動化的電鏡來說，并非難事。難點在于如何對這些照片進行后期處理。弗蘭克開發出一種識別和合成的軟件，可以將從數以萬計的照片中找到那些朝向相似的生物大分子挑選出來，然后再合成一張清晰的圖像，再把不同方向的清晰圖像合成起來，就可以得到生物大分子的三維結構了。

我們以常見的CT舉個例子。如果醫生想看到患者腦組織的三維圖像，就需要用x射線從不同的方向掃描腦部，然后通過這些投影反推得到腦部的三維圖像。這與冷凍電鏡技術的三維重構原理十分相似：如果樣品不具有任何對稱性，那么就需要沿著物體的不同方向進行投影，再通過反傅里葉變換得到物體的三維圖像。

弗蘭克發明的方法被學術界稱為“單粒子冷凍電鏡三維重建”技術。單粒子法就是對分離純化的顆粒狀分子進行結構分析。既可以對有20面對稱結構的病毒或螺旋對稱結構進行分析，也可以對像核糖體等大的可溶性復合物進行結構分析，還可以對溶解狀態的膜蛋白進行分析。

如今，超過90%的冷凍電鏡都應用這項技術來分析生物大分子。弗蘭克的軟件降低了圖片分析的門檻，讓這項技術擁有了普遍的應用價值。具有里程碑意義的成果是，2013年加州大學舊金山分校的程亦凡、大衛·朱利葉斯等人首次得到膜蛋白TRPV1的近原子級別高分辨率三維結構，結果發表在英國出版的《自然》雜志上。

冷凍電鏡的作用

理解生物大分子和大的復合物的反應機制是當今生物學領域里的一項重要目標。而冷凍電鏡可以很好地完成這項任務。冷凍電鏡的優勢在于能夠在盡可能接近其天然形態的水合狀態下觀察大分子。這種在原子分辨率下捕獲生物分子的圖像和結構的能力，將極大地幫助研究人員理解關鍵的生物過程，并建立結構與功能之間的關聯。

長期以來，由于對分子結構的不了解，許多疾病沒辦法治療，而如今技術和發明日新月異，意味著我們在將來可以針對很多的疾病，研發出非常有效的藥。冷凍電鏡技術的進展聽上去很簡單：分辨率提高到0.35納米。然而，這意味著我們可以看見原子，看見化學變化的過程，看見原子如何排列成分子，看見病灶的組織結構如何改變。未來，或許我們還將看見某種藥物可以阻止大腦衰老。

冷凍電鏡技術在幫助醫生了解細胞變化過程和發病機理上發揮了重要作用，并且有助于藥物開發。例如，在寨卡病毒的研究中，病毒結構解析就起了重要作用。2016年以來，寨卡疫情引起了全世界的關注。這種由伊蚊傳播的病毒與出生缺陷以及神經系統自身免疫疾病存在關聯。冷凍電鏡成功地觀測到寨卡病毒的結構，這是傳統電子顯微鏡無法做到的，也是這項新技術實際應用的一個很好的例子。

目前，冷凍電鏡分辨率已經很高，可以獲得生物大分子的原子結構。如今，科學家還在進一步努力提高冷凍電鏡的分辨率，以便揭示更多蛋白的結構和功能。從而更好地了解細胞變化過程、發病機理并開發治療手段。（責任編輯 張虹）