亮氨酸拉鏈型脂肽對脂質體溫敏性調節的分子模擬

許謝君，肖興慶，徐首紅，劉洪來,＊

1華東理工大學化學與分子工程學院，化學工程國家重點實驗室，上海 200237

2 Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695-7905, USA.

1 引言

癌癥已逐漸成為人類健康的頭號大敵，目前的癌癥治療手段仍以化學治療方法為主—使用抗癌藥物直接作用于癌細胞進而殺死癌細胞1,2。由于大部分抗癌藥物有很強的毒性，殺死癌細胞的同時存在著破壞正常細胞和健康的內臟組織的可能。應用擁有靶向性的藥物載體將藥物準確輸送至癌細胞周圍再釋放，可以大大降低上述副作用。

脂質體因其特有的良好生物相容性而逐漸受到重視而被做為藥物載體。但傳統脂質體的靶向性不足，通過各個途徑進入人體血液循環后，無法被輸運至特定的癌變部位，導致藥效大大不如預期甚至危害到人體的健康器官和組織。近年來，對傳統脂質體進行修飾和改造以提高其靶向性的研究受到廣泛關注，目前已經有許多新型脂質體3,4被開發和使用。另一方面，脂質體被準確輸運至癌細胞周圍的同時還需要脂質體能快速釋放出抗癌藥物，這就要求脂質體須在正常組織環境下保持穩定，而在癌細胞周圍喪失穩定性進而將其負載的抗癌藥物釋放出來以殺死癌細胞。由于癌變組織所在位置常常會出現pH、溫度等方面的異常，因此pH或溫度敏感的脂質體的開發成為藥物載體研究的重要方向。Hyperthermia療法5是一種針對局部病灶進行加熱進而殺死特定位置癌細胞的放射治療方法，利用局部升溫這一特點，溫敏性的脂質體就可以攜帶抗癌藥物到達高溫病灶部位，借由局部高溫破壞脂質體的穩定性在病灶處釋放出抗癌藥物來準確地殺死癌細胞。Al-Ahmady等人6首次將亮氨酸拉鏈的結構[VSSLESK-VSSLESKVSKLESK-KSKLESK-VSKLESK-VSSLESK]引入脂質體，得到了一種新型的溫敏脂質體(圖1)，這種新型的溫敏脂質體可以配合hyperthermia療法使用。

亮氨酸拉鏈7,8是一種獨特的七元重復單元結構(abcdefg)n(圖2)，其中亮氨酸總是出現在七元重復單元的d的位置上，所以稱之為亮氨酸拉鏈結構。它通過疏水作用形成多聚體的立體結構，當溫度升高至特定溫度時，會解離成無序的肽單體，利用這一特性Al-Ahmady等6對傳統溫敏脂質體進行了改良得到了熱敏性更佳的新型溫敏脂質體。

圖1 包含亮氨酸拉鏈型脂肽的溫敏性脂質體Fig. 1 Thermosensitive liposome with leucine zipperstructured lipopeptides.

圖2 亮氨酸拉鏈型脂肽結構Fig. 2 Leucine zipper-structured lipopeptides.(a) double helix structure of leucine zipper; (b) overhead view of a leucine zipper, where site d is predominantly occupied by the leucine residue.

表1 亮氨酸拉鏈型脂肽及其序列Table 1 Sequences of leucine zipper-structured lipopeptides.

我們課題組對這種嵌入了亮氨酸拉鏈的溫敏脂質體做了進一步的改良9-11，我們設計了新的氨基酸殘基序列[VAQLEVK-VAQLESK-VSKLESKVSSLESK]，并在N端進行修飾加入了不同的功能性頭基，以期改善脂肽溫敏性進而得到更適宜的溫敏脂質體。我們主要以烷烴類頭基作為修飾，實驗發現隨著烷烴頭基碳鏈的增長脂肽轉變溫度也隨之升高，說明烷烴頭基碳鏈的加長會提高脂肽的熱穩定性10。為了探索不同修飾基團對脂肽溫敏性的影響以設計更適宜的溫敏脂肽，從分子角度解釋溫敏性脂肽的特性，為開發更好的溫敏脂質體提供參考，我們用分子動力學模擬進行了探索性的研究。在前期工作中12，我們使用隱式溶劑模型的副本交換分子動力學(replica exchange molecular dynamics，REMD)模擬方法研究了2種不同頭基的亮氨酸拉鏈結構脂肽單體(ALA，C5CO)，并采用二面角主成分分析法(dihedral principal component analysis，dPCA)結合DSSP程序得到這兩種亮氨酸拉鏈型脂肽的轉變溫度分別為324.8 K以及319.1 K，其中C5CO鏈的轉變溫度319.1 K與實驗測定的該鏈的轉變溫度321.1 K相當接近，證明了這種模擬方法對于亮氨酸拉鏈型脂肽研究的可行性9。為了進一步探索N端修飾對于脂肽溫敏性的影響，我們又設計了另外2種不同頭基修飾的亮氨酸拉鏈脂肽，并進行REMD模擬，以期判斷頭基與脂肽溫敏性的相關影響關系。在原有研究的基礎上，本文還構建了嵌入溫敏性脂肽二聚體的DPPC脂質體，使用分子動力學模擬的方法研究溫敏性脂肽對于脂質體相轉變溫度的影響。

2 模擬方法

2.1 亮氨酸拉鏈結構脂肽

我們在原有的亮氨酸拉鏈肽鏈序列[VAQLEVK-VAQLESK-VSKLESK-VSSLESK]的N端修飾兩種不同功能性頭基，獲得了兩種新型亮氨酸拉鏈型脂肽，分別命名為C3CO以及POCH脂肽，其結構如表1所示。

C3CO脂肽的設計主要是用于與C5CO脂肽進行比較，以探索N端烷烴頭基長度對于脂肽轉變溫度的影響并印證實驗規律的正確性10；POCH脂肽使用的是磷脂DPPC的頭基，引入這一頭基主要是為了考察磷脂頭基與烷烴頭基對于脂肽溫敏性作用的差異性，以此尋找更多可行的功能性基團。因為所使用的亮氨酸序列都是帶有一價正電荷，所以在模擬時我們加入了對應數量的反離子Cl-使得整個體系保持電中性。

2.2 亮氨酸拉鏈型脂肽的模擬方法

2.2.1 量子力學計算

在亮氨酸拉鏈序列的N端修飾了一個CH3―(CH2)2―CO―疏水基團，在標準Amber力場里并沒有包含此疏水基團的電荷(文中電荷單位皆為Gromacs基本電荷單位電子電荷e)，所以需要使用Gaussian 09W軟件進行量化計算以得到該基團的原子電荷。由于在C3CO脂肽中，CH3―(CH2)2―CO―的疏水基團直接連接著纈氨酸殘基(V)，所以在量化計算時也將CH3―(CH2)2―CO―的疏水基團與纈氨酸殘基(V)直接連接，如圖3。

圖3 連接著纈氨酸的疏水性基團CH3―(CH2)2―CO―Fig. 3 The hydrophobic group CH3(CH2)2―CO―capped by the valine residue.The total charge of the molecule is +e.

表2 疏水性基團CH3―(CH2)2―CO―的電荷Table 2 Partial charges of the hydrophobic group CH3―(CH2)2―CO― in the C5CO peptide.

因為b3lyp/6-31g(d)是利用電子密度取代波函數作為描述體系能量的變量，所優化得到的分子構型更接近于其在真實水溶液中的構型，所以我們先使用b3lyp/6-31g(d)基組對分子結構進行優化。然后再在HF/6-31g(d)下計算得到了分子的表面靜電勢，HF/6-31g(d)方法計算分子表面靜電勢是其在真空狀態下的靜電勢，進而擬合出其在真空狀態下的點電荷。在隨后的全原子分子模擬過程中，無論是利用隱式水模型還是顯式水模型，水對電荷相互作用的影響都已經考慮進去。最后通過兩步法(RESP)13-15得到了各原子的電荷，見表2，具體細節可以參考我們的前期工作12。

2.2.2 交換分子動力學模擬

使用Gromacs 4.5.5程序包16,17在Amber force field 14SB力場18下進行所有的隱式溶劑模型REMD模擬，GBSA方法使用Onufriev-Bashford-Case模型19處理溶劑效應。共軛梯度法被應用于初始結構的能量優化，接著將優化好的C3CO和POCH單鏈結構在16個不同溫度下(285、295、300、305、310、315、320、325、330、335、360、380、410以及460 K)進行100 ns的REMD模擬。V-rescale和Berendsen weak coupling算法分別被用于溫度和壓力的平衡，具體細節可以參考先前的工作12。

2.3 質體模擬研究

2.3.1 質體建模

在亮氨酸拉鏈結構單鏈的研究基礎上，本文還著重研究了脂肽對于脂質體相轉變溫度的影響。為了能夠更顯著的觀察亮氨酸拉鏈型脂肽對于脂質體相轉變溫度的影響，我們選擇了轉變溫度最高的ALA脂肽(324.8 K)以及轉變溫度最低的C3CO脂肽(312.1 K)進行模擬。將脂肽多聚體嵌入同一種脂質體DPPC中，搭建了一個包含脂肽、水以及DPPC的大分子生物體系。由于脂質體所含分子數過多，如果模擬一個完整的脂質體將耗費過多的計算時間，而實際上通過模擬脂質體的一部分就可以得到關于脂質體穩定性的準確信息，故本文使用PACKMOL軟件20,21僅搭建了脂質體的一部分結構進行模擬分析。

首先使用SWISS model軟件22-24生成了2個脂肽(ALA，C3CO)的二聚體結構，用PACKMOL軟件建立DPPC脂質體結構并嵌入二聚體。模擬系統為一個7.2 nm × 7.2 nm × 10 nm的盒子，在0 ≤Z≤ 2.5 nm以及7.5 nm ≤Z≤ 10 nm的空間中分別加入2738個水分子總共5496個水分子，在2 nm ≤Z≤ 5 nm以及5 nm ≤Z≤ 8 nm的空間中分別加入60個排列整齊的DPPC分子形成一個簡單的雙分子層結構，在雙分子層中心位置插入一個由SWISS model構建的脂肽二聚體結構，由此得到了2個含有不同亮氨酸拉鏈型脂肽的DPPC雙分子層結構以及1個不包含脂肽的DPPC雙分子層結構作為分子動力學模擬的初始結構，見圖4。體系中添加了對應數量的反離子Cl-，使得體系呈電中性。

2.3.2 肽的脂質體的模擬方法

本文使用Amber 15軟件包進行脂質體的模擬分析。綜合考慮肽鏈ALA以及C3CO的轉變溫度，我們選擇了它們的轉變溫度(324.8和312.1 K)附近的四個溫度310、315、320以及325 K作為模擬溫度，在每個溫度下均進行50 ns的分子動力學模擬。

Amber force field 14SB力場18被用于脂肽二聚體，Amber force field lipid 14力場25被用于DPPC脂質體，而水分子則是使用TIP3Pmodel26。模擬的詳細流程如下：(1)先進行5000步的最陡下降法和共軛梯度法對脂肽和脂質體進行能量優化，接著再對整個系統進行5000步的能量優化；(2)將系統溫度從0 K開始緩慢提升，先以10 K/1000步的速度上升到300 K，接著以5 K/1000步的速度上升到模擬溫度；(3)在NPT系綜下運行5 ns使系統維持在標準大氣壓下即101.325 kPa；(4)最后運行50 ns的分子動力學模擬。

圖4 含有亮氨酸拉鏈結構的DPPC雙分子層的初始結構Fig. 4 Initial structures of the lipopeptide dimers complexed with lipid DPPC bilayer and water.(a) blank, (b) ALA, (c) C3CO.

3 結果與討論

3.1 脂肽模擬分析

在100 ns的C3CO和POCH單鏈的REMD模擬后，我們選擇最后30 ns的軌跡文件進行分析，計算了兩條鏈在各個溫度下勢能的變化并且選擇了325 K為初始副本溫度的這一副本繪制了它的溫度隨模擬的進行的溫度交換曲線(圖5)。從圖5可以看到，最后30 ns中各相鄰溫度的勢能有著充分的重疊，相鄰溫度也有著充分的交換，說明了最后30 ns的軌跡是可以用于分析和討論的。

我們選擇最后30 ns的軌跡文件進行二面角(φ和ψ)主成分分析(dPCA)27,28進一步得到自由能面圖(圖6)。以φ為例，從圖6中可以看到，無論是C3CO還是POCH脂肽，其自由能面圖的深色區域都是隨著溫度的升高而擴大，這說明了脂肽結構的穩定性會隨著溫度的升高而降低，意味著亮氨酸拉鏈型脂肽存在著溫度敏感性，這與實驗現象相一致9。

自由能面圖中的最深色區域就是相對自由能最低的區域，從中可以得到該溫度下的單鏈特征結構。每個單鏈有16個模擬溫度，每個溫度選擇兩種二面角進行主成分分析，每個二面角自由能面圖中取3個特征結構，因此對于每一種單鏈，選擇了96個點進行分析。

在得到了96個特征結構后，我們使用DSSP方法29結合最小二乘法確定C3CO以及POCH脂肽的轉變溫度，見圖7。可以看到C3CO的轉變溫度為312.1 K而POCH的轉變溫度為319.4 K，之前的工作中12得到的C5CO脂肽的轉變溫度為319.1 K，由此可知疏水頭基中烷烴碳鏈的增長會提高脂肽的轉變溫度，即提高脂肽的熱穩定性，這一規律與實驗所述規律保持一致10；而POCH脂肽的轉變溫度319.4 K和C5CO脂肽的轉變溫度319.1 K相當接近，其中C5CO脂肽已經在實驗中9得到認可，說明POCH脂肽對于該新型溫敏脂質體也具有開發潛質。

3.2 脂質體模擬分析

結合SWISS model和PACKMOL兩個軟件搭建了含有2種不同亮氨酸拉鏈型脂肽(ALA與C3CO)以及1個不包含脂肽的DPPC藥物載體的初始結構，利用AMBER 15軟件在脂肽的轉變溫度附近(310、315、320、325 K)進行50 ns的分子動力學模擬。

圖5 亮氨酸拉鏈的勢能概率分布圖((a) C3CO，(b) POCH)以及亮氨酸拉鏈在325 K副本下副本交換圖((c) C3CO，(d) POCH)Fig. 5 The probability distributions of the potential energy of the replicas ((a) C3CO, (b) POCH) and time series of temperature exchanges at 325 K ((c) C3CO, (d) POCH).

圖6 (a，b) 285 K，(c，d) 325 K以及(e，f) 380 K溫度下，C3CO、POCH脂肽的自由能面圖(φ)Fig. 6 Free energy landscape (φ) along the first two principal components (V1, V2) for the C3CO lipopeptide at(a) 285 K, (c) 325 K and (e) 380 K, and for the POCH lipopeptide at (b) 285 K, (d) 325 K and (f) 380 K.

圖7 溫度對于(a) C3CO，(b) POCH脂肽的α螺旋結構的影響Fig. 7 The effect of temperature on the α-helical conformation of the (a) C3CO and (b) POCH lipopeptides.The least square method is used to determine the temperature-dependence conformation transition. Calculation errors are estimated by the standard errors of the mean.

通過50 ns的分子動力學模擬，得到了模擬過程中RMSD隨時間的變化曲線，圖8。從圖中可以看到，3種不同結構的RMSD分別在4個不同溫度下逐漸趨于穩定，這說明這16個50 ns的模擬結果是穩定可靠的。因此我們選擇了最為平衡的最后5 ns軌跡進行分析，研究不同脂肽對于脂質體DPPC的影響。

脂分子面積指的是單個磷脂分子所占空間的面積(不包含Z方向)，是磷脂分子的主要特征之一，可由下式計算得到：

圖8 脂肽二聚體在50 ns分子模擬中在310，315，320以及325 K的RMSD曲線Fig. 8 The RMSD profiles of the lipopeptide dimers in the 50 ns conventional MD simulations at 310, 315, 320 and 325 K.(a) blank, (b) ALA, (c) C3CO.

Slipid= (X × Y)·nlipids(1)其中Slipid代表脂分子面積，X代表盒子在X方向的總長度，Y代表盒子在Y方向的總長度，nlipids代表每層所含有的磷脂分子總數(在本實驗中，n = 60)。

電子密度分布表示了脂質體單位體積內所含電子數目的多少。電子密度分布經常與實驗所得的結果進行比較以此來判斷模擬的正確性，而本文利用這一分布來觀察脂質體的穩定性。

以脂質體中心面Z = 0為基點，就可以得到距離Z = 0這一平面不同位置處單位體積脂質體的電子密度。

ρe= ne/(X × Y × Zi) (2)其中ρe代表電子密度，ne代表在所選擇空間中總的電子數，X代表盒子在X方向的總長度，Y代表盒子在Y方向的總長度，Zi代表所選擇空間距離雙分子層結構中心面Z = 0的Z方向的長度。

脂分子面積是對磷脂分子縱向切割后的分析，而電子密度分布則是對磷脂分子橫向切割后的分析，綜合兩者可以觀察脂質體整體的變化。

圖9的a、b、c三個子圖是包含不同亮氨酸拉鏈型脂肽的DPPC脂質體的脂分子面積隨溫度的變化曲線。可以看到，在選擇的310-325 K溫度區間內，所有脂質體的脂分子面積都是隨著溫度的升高而變大，這說明隨著溫度的升高單個磷脂分子所占據的空間增大，也就意味著隨著溫度的升高，磷脂雙分子層在逐漸解聚。

圖9 310，315，320和325 K時DPPC脂質體的脂分子面積以及電子密度隨溫度的變化曲線Fig. 9 The area per lipid for DPPC bilayers and electron-density profile for DPPC bilayers at 310, 315, 320 and 325 K.(a, d) blank, (b, e) ALA, (c, f) C3CO.

再通過最小二乘法得到了各個含有不同脂肽的脂質體雙分子層的相轉變溫度，結果顯示不包含脂肽的DPPC相轉變溫度為315.1 K，包含ALA脂肽的DPPC相轉變溫度為319.9 K，包含C3CO脂肽的DPPC相轉變溫度為314.4 K。結合ALA脂肽的轉變溫度324.8 K以及C3CO脂肽的轉變溫度312.1 K可以說明這種全新改良的亮氨酸拉鏈型脂肽的加入對于DPPC脂質體的相轉變溫度有顯著的影響。當脂肽的轉變溫度高于脂質體原本的相轉變溫度315.1 K時，脂肽的加入會使得DPPC的相轉變溫度升高；反之，如果所加入的脂肽轉變溫度低于脂質體原本的相轉變溫度，那么脂質體的相轉變溫度會降低。

由圖9的d、e、f可以看到，隨著溫度的升高，在相同距離處的磷脂雙分子層的電子密度都在降低，這反映了對于脂質體的橫向空間其體積在不斷擴大，也說明了隨著溫度的升高磷脂雙分子層會發生解聚。

從每個磷脂雙分子層隨溫度變化而產生的電子密度變化曲線中可以看出脂質體的結構突變點的溫度范圍：無脂肽為310-315 K，含有ALA脂肽為320-325 K，含有C3CO脂肽為310-315 K，這與圖9(a)、(b)、(c)中的各個DPPC脂質體的相轉變溫度315.1、319.9、314.4 K相一致。

4 結論

本文采用分子動力學模擬的方法，對亮氨酸拉鏈型脂肽以及嵌入該脂肽的新型溫敏脂質體進行了模擬研究。通過隱式水模型REMD模擬得到了C3CO和POCH兩條新型亮氨酸拉鏈型脂肽的轉變溫度分別為312.1和319.4 K，結合前期工作12得到的C5CO脂肽轉變溫度319.1 K，發現隨著疏水頭基烷烴碳鏈的增長脂肽的轉變溫度也會隨之升高，這一規律與實驗10所得規律相吻合。通過比較嵌入2種不同亮氨酸拉鏈型脂肽(ALA，C3CO)的DPPC磷脂雙分子層與未嵌入脂肽的DPPC磷脂雙分子層的模擬結果，綜合脂分子面積以及電子密度分布隨溫度的變化，證明這種新型的溫敏亮氨酸拉鏈型脂肽二聚體的加入確實會影響DPPC脂質體的相轉變溫度，且相轉變溫度的大小是由脂肽轉變溫度的高低決定的。這就說明我們只需調整脂肽的修飾頭基的結構，改變其轉變溫度就能控制磷脂的相轉變溫度，進而得到效果更佳的新型溫敏脂質體。這一發現有利于該類藥物載體的優化設計，也為設計和改良新型的溫敏性脂質體藥物載體提供了更大的可能。