白細胞介素-6受體、白細胞介素-27基因多態性與冠心病易感性的相關性研究

冠心病是導致人類死亡最常見的原因之一。WHO報告顯示，冠心病死亡率占全球總死亡率的12.9%[1]。隨著人民生活水平的提高與老齡化進程的加快，中國冠心病的發病率、死亡率逐年上升[2]。研究表明，免疫炎癥反應在冠心病的發生發展過程中發揮著重要作用。白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是細胞中重要的促炎因子，IL-6與其受體(IL-6R)結合后，可誘導多種細胞分化、成熟及凋亡[3-4]。白細胞介素-27(interleukin-27，IL-27)是由p28亞基與EB病毒誘導基因3(Epstein Barrvirus induced gene 3，EBI3)亞基結合形成的異源二聚體，具有促炎和抗炎雙向調節作用。研究發現，IL-6、IL-27基因多態性與炎癥、免疫、腫瘤、病毒感染等疾病密切相關[5-6]。但目前關于IL-6R、IL-27基因多態性與冠心病關聯分析的研究還較少。本研究通過檢測冠心病病人IL-6R、IL-27基因型，分析其與冠心病易感性的關系，從遺傳學角度探究冠心病的發病因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院心血管內科2015年6月—2017年8月收治的冠心病病人226例為試驗組，其中男163例，女63例；年齡37～86(60.42±17.83)歲。全部病例符合1979年WHO公布的冠心病診斷標準[7]。采用Judkins法[8]進行冠狀動脈造影，冠狀動脈主要分支狹窄程度≥50%確診為冠心病。所選病例均排除腫瘤、腦血管疾病、血液系統疾病、急慢性感染、嚴重肝腎疾病、全身免疫性疾病等。另選擇同期于本院體檢且年齡等相仿的200名身體健康者作為對照組，年齡40～80(62.74±18.39)歲；男150名，女50名。兩組受試者的性別、年齡等臨床資料差異無統計學意義(P>0.05)。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 臨床資料 收集所有受試者身高、體重、血壓、血漿總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，凝血四項指標包括凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原(FIB)等。

1.3 主要試劑 Platinum Taq DNA聚合酶購自南京金思特科技公司；IL-6R和IL-27引物購自上海生工公司；人外周血基因組DNA提取試劑盒購自中國康為世紀生物公司；ABI9700型PCR擴增儀購自美國Applied Biosystem公司；紫外分光光度計購自美國Bio-Rad公司；瓊脂糖凝膠電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.4 基因組DNA的提取 全部受試者均空腹采集6 mL肘靜脈血液，用EDTA-Na進行抗凝處理。采用DNA提取試劑盒提取各受試者的全血基因組DNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。紫外分光光度計檢測DNA純度及濃度，OD260/280為1.8～2.0，可用于后續試驗。將DNA稀釋至20 ng/μL后分裝，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.5 IL-6R和IL-27基因多態性的檢測 使用HapMap數據庫和Haploview軟件選擇IL-6R和IL-27的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點，最終6個SNP位點被研究。采用高分辨率溶解曲線(PCR-HRM)技術對IL-6R和IL-27基因進行分型，引物序列見表1。PCR-HRM反應體系的配制：10×Buffer 2.0 μL、10 mmol/L dNTPs 0.4 μL、20 μmol/L上下游引物各0.5 μL、DNA 2.0 μL、Platinum Taq DNA聚合酶0.16 μL，最后加ddH2O至20 μL；反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性25 s，62 ℃退火延伸40 s，10個循環；95 ℃變性25 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，27個循環；72 ℃延伸2 min。HRM條件：96 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，對72～90 ℃的溶解曲線數據進行收集。根據溶解曲線峰型變化對IL-6R和IL-27基因進行分型。

表1 IL-6R和IL-27基因各SNPs引物序列

2 結 果

2.1 兩組受試者基線資料比較 兩組受試者年齡、性別、體質指數(BMI)、收縮壓、舒張壓等資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，試驗組血脂指標TG、LDL-C水平均顯著升高(P<0.05)，而TC水平顯著降低(P<0.05)。與對照組比較，試驗組凝血指標PT顯著延長、FIB升高(P<0.05)，而TT顯著縮短(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組受試者基線資料比較(±s)

2.2 兩組受試者血清IL-6R基因多態性分析 PCR-HRM結果證實，IL-6R(183A/G)檢測到3種基因型：AA、AG、GG；IL-6R(exon1A/C)檢測到3種基因型：AA、AC、CC；IL-6R(exon2A/T)檢測到2種基因型：AT、TT。IL-6R基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗。IL-6R(183A/G)的基因型及等位基因頻率在試驗組和對照組間的差異無統計學意義(P>0.05)。IL-6R(exon1A/C)和IL-6R(exon2A/T)的基因型及等位基因頻率在試驗組和對照組間的差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組受試者血清IL-6R基因型及等位基因頻率 例(%)

2.3 兩組受試者血清IL-27基因多態性分析 PCR-HRM結果證實，IL-27(4730T/C)檢測到2種基因型：TT、TC；IL-27(-964A/G)檢測到3種基因型：AA、AG、GG；IL-27(2905T/G)檢測到2種基因型：TT、TG。IL-27基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗。IL-27(4730T/C)、IL-27(-964A/G)和IL-27(2905T/G)的基因型及等位基因頻率在試驗組和對照組間的差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表4。

2.4 IL-6R和IL-27基因多態性與冠心病發生風險的關聯分析 對基因型及基因頻率在試驗組和對照組間的差異有統計學意義的兩個位點，即IL-6R(exon1A/C)、IL-6R(exon2A/T)，采用Logistic回歸分析這兩個位點的突變基因型與冠心病發生風險的相關性。以野生純合型為基準，突變基因型為啞變量。IL-6R(exon1A/C)的突變雜合基因型AC與野生純合型AA間的差異無統計學意義(P>0.05)，而突變純合基因型CC與野生純合型AA間的差異有統計學意義(P<0.05)，其突變基因型可降低冠心病的發病風險。IL-6R(exon2A/T)的突變雜合基因型AT與野生純合型TT間的差異有統計學意義(P<0.05)，其突變基因型可增加冠心病的發病風險。詳見表5。

表4 兩組受試者血清IL-27基因型及等位基因頻率 例(%)

表5 IL-6R和IL-27基因多態性與冠心病發生風險的Logistic回歸分析

2.5 IL-6R和IL-27基因多態性與冠心病病人血清指標的關系 將IL-6R、IL-27基因多態性與冠心病病人血清指標檢測結果進行統計分析發現，IL-6R(exon1A/C)的基因型與血脂指標TC、HDL-C顯著相關(P<0.05)。詳見表6。

表6 IL-6R和IL-27基因多態性與冠心病病人血清指標的關系

3 討 論

冠心病是一種遺傳和環境因素相互作用造成的復雜性疾病。有研究發現，家族遺傳因素與冠心病的發生密切相關，那么發掘與冠心病相關的基因多態性，成為防治冠心病的關鍵[9]。動脈粥樣硬化是冠心病發生的主要危險因素，而動脈粥樣硬化是由血管管壁慢性炎癥反應所致，細胞因子如白細胞介素、腫瘤壞死因子、C-反應蛋白等在該過程中發揮重要作用[10]。細胞因子的生成由基因所調控，基因多態性可能會影響細胞因子的表達[11]。因此，細胞因子多態性可能與疾病的發生有關。IL-6主要是由單核巨噬細胞、血管內皮細胞、Th2細胞等細胞合成分泌，在血液中廣泛存在，介導各種免疫、炎癥反應。IL-6的主要功能有促進活化B細胞分化成熟，促進T細胞活化增殖，促進肝細胞在急性炎癥期合成炎性因子等。IL-6與其靶細胞表面的IL-6R特異性結合后，可激活gp130并與其結合成三元復合物，啟動Janus家族酪氨酸激酶信號傳導與轉錄活化因子(JAK/STAT3)途徑和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑發揮作用[12-13]。大量研究證實，冠心病病人血清中的IL-6、IL-6R表達量顯著高于正常對照組，表明IL-6、IL-6R可能參與冠心病的發病過程[14]。另有研究證實，血清IL-6含量可預測冠心病的發病風險，且與冠心病的病情進展、預后均有關[15]。由于IL-6、IL-6R表達量由基因所調控，因此分析IL-6、IL-6R基因多態性與冠心病易感性的關系可為該病的發病機制提供新線索。目前關于IL-6基因多態性的研究相對較多，但關于IL-6R基因多態性的研究還很少。本研究就IL-6R基因多態性與冠心病易感性的關系進行了研究，結果發現IL-6R(exon1A/C)和IL-6R(exon2A/T)在試驗組和對照組間的差異均有統計學意義，IL-6R(exon1A/C)的突變純合基因型CC可降低冠心病的發病風險，而IL-6R(exon2A/T)的突變雜合基因型AT可增加冠心病的發病風險，說明IL-6R基因多態性與冠心病易感性有關。IL-6R(exon1A/C)的基因型與血脂指標TC、HDL-C顯著相關，說明IL-6R基因多態性與脂質代謝也有關。

IL-27是一種新型的IL6/IL12家族炎性因子，在炎癥反應的不同階段或不同刺激下發揮雙向調控作用，一方面能促進初始CD4+T細胞分化成Th1型細胞，促進炎癥反應的發生；另一方面又能抑制Th17細胞合成分泌IL-17，從而發揮抗炎作用[16]。IL-27在冠心病中的作用目前尚有爭議。有研究發現，急性心力衰竭病人血清中IL-27水平顯著高于正常對照組，故而認為IL-27可促進缺血性心臟病的發生[17]。另有研究發現，IL-27可通過抑制巨噬細胞的活性來減緩小鼠動脈粥樣硬化的病情進展[18]。目前從遺傳角度研究IL-27基因與冠心病關系的報道還很少。本研究就IL-27基因多態性與冠心病易感性的關系進行了研究，結果發現IL-27(4730T/C)檢測到2種基因型：TT、TC；IL-27(-964A/G)檢測到3種基因型：AA、AG、GG；IL-27(2905T/G)檢測到2種基因型：TT、TG。但IL-27(4730T/C)、IL-27(-964A/G)和IL-27(2905T/G)的基因型及等位基因頻率在試驗組和對照組間的差異均無統計學意義，而且IL-27基因型與血脂指標(TC、TG、LDL-C、HDL-C)及凝血指標(PT、APTT、TT、FIB)均無關，說明IL-27基因多態性與冠心病易感性、脂質代謝均無關。

本研究結果初步表明，血清IL-6R(exon1A/C)、IL-6R(exon2A/T)多態性與冠心病易感性有關，且IL-6R(exon1A/C)的基因型與血脂指標TC、HDL-C顯著相關，而IL-27基因多態性與冠心病易感性無關。IL-6R基因多態性與冠心病易感性及脂質代謝的相關性，可能為冠心病的發生機制提供一定的參考價值。