益氣養陰通絡法通過JAK/STAT通路對急性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡的影響

急性心肌缺血表現為冠狀動脈的急性閉塞所致的心肌細胞缺血、缺氧、凋亡的一系列過程，為臨床常見病，威脅著人類健康。有研究表明，急性心肌梗死后的心肌細胞中存在細胞凋亡[1]。JAK-STAT信號通路在心肌缺血再灌注過程中對心臟有重要的保護作用[2]，當其受到抑制，可激活Caspase-3前體，啟動細胞凋亡[3]。本研究采用具有益氣養陰通絡功效的雙參通脈顆粒干預大鼠急性心肌缺血模型，觀察其對JAK/STAT通路的影響，探討中藥干預心肌細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 雙參通脈顆粒，由遼寧中醫藥大學附屬醫院制劑室提供，由人參、黃芪、麥冬、當歸、丹參、川芎等組成，采用傳統顆粒制備方法，批號 20160531。鹽酸地爾硫卓片，天津田邊制藥有限公司生產，每片30 mg，國藥準字： H12020126。麻醉藥水合氯醛(上海化學試劑有限公司，批號分別為 20130413，20131127)，現用現配； EliVision plus試劑盒(中國福州邁新生物科技有限公司kit-9902)，DAB Kit(中國福州邁新生物科技有限公司DAB-1031)，蘇木素染色液(中國南京建成公司 D005)，Invent 總蛋白提取試劑盒(美國 Invent SD001/SN002)。

1.1.2 實驗儀器 MP150 多導生理信號采集系統(德國Leica公司)、高速臺式離心機(德國Eppdendorf公司)、BB23型培養箱(美國PE公司)、ROTEAN 電泳系統(美國Bio公司)、冰凍切片機OM3123 型(瑞典Bio公司)、恒溫恒濕箱(上海科技生物公司)、多功能酶標儀(美國Cell Signaling公司)等。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 選取健康SD大鼠，共60只，隨機分為6組，即假手術組、模型組、西藥組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組10只。對模型組、中藥各劑量組、西藥組實驗動物進行造模，復制急性心肌缺血模型。取大鼠稱重，采用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g，腹腔麻醉后固定于手術臺上，氣管切開，呼吸機輔助呼吸(頻率 85 次/min，潮氣量 18 mL，吸呼比1∶1)，連接心電檢測儀，術中記錄Ⅱ導聯心電圖。于左冠狀動脈前降支起始下2 mm處結扎，假手術組不結扎，檢查無出血，逐層關閉胸腔。

1.2.2 給藥方法 按人和動物等效劑量換算法折算大鼠劑量進行換算，假手術組及模型組予生理鹽水灌胃每次3 mL，每日2 次。西藥組予以鹽酸地爾硫卓片灌胃，劑量為4.23 mg/kg。中藥低劑量組給予相當生藥量9.37g/(kg·d)；中藥中劑量組給予相當生藥量18.75 g/(kg·d)；中藥高劑量組給予相當生藥量37.5 g/(kg·d)，均制成 6 mL，每次3 mL，每日2 次，療程2周。

1.2.3 血流動力學測定 取材前分離右側頸總動脈，左心導管插管至左心室，由 ALC-MPA 多導生物信號分析系統記錄血流動力學參數。

1.2.4 免疫組化法檢測P-STAT3蛋白表達 取心肌組織連續2塊厚2～3 mm，將標本固定于4%多聚甲醛中，觀察各級乙醇脫水，石蠟固定進行常規切片，按常規方法進行脫蠟，水合，再于二甲苯、各級乙醇中脫水，抗原修復，抗原-抗體反應，蘇木精-伊紅(HE)復染，二甲苯透明、濾紙吸干、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織細胞中蛋白的表達情況。

1.2.5 蛋白提取及指標檢測 取缺血心肌組織數塊，提取蛋白，進行蛋白定量，SDS-PAGE電泳。采用Western blot方法測定心肌細胞中的Caspase-3蛋白表達。

2 結 果

2.1 各組大鼠左心室功能檢測 治療結束后中藥各劑量組大鼠血流動力學參數均發生了改變，與模型組相比，各治療組左心室收縮功能(LVSF)明顯升高(P<0.05)，左心室舒張功能(LVDF)顯著降低(P<0.05)； 中藥高劑量組血流動力學改善最明顯。詳見表1。

表1 各組大鼠左心室功能比較(±s)mmHg

與假手術組比較，1)P<0.05； 與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 各組大鼠P-STAT3蛋白表達 與假手術組比較，模型組P-STAT3蛋白表達明顯降低；與模型組比較，各治療組P-STAT3蛋白表達均升高，其中，中藥高劑量組蛋白表達升高明顯。詳見圖1、表2。

假手術組 模型組 西藥組

中藥低劑量組 中藥中劑量組 中藥高劑量組

圖1各組大鼠P-STAT3蛋白表達

表2 各組大鼠P-STAT3蛋白表達光密度平均值(IOD/area)比較(±s)

與假手術組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.3 各組大鼠心肌細胞中Caspase-3蛋白表達 與假手術組比較，模型組Caspase-3表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組Caspase-3表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01) 。中藥高劑量組與西藥組、中藥中劑量組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖 2。

與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

圖2Westernblotting檢測各組Caspase-3蛋白表達

3 討 論

JAK/STAT通路參與了多種細胞因子和生長因子介導的信號傳遞，心肌缺血缺氧產生多種細胞因子，激活 JAK-2，啟動 JAK/STAT 信號通路，使 STAT3 磷酸化，P-STAT3二聚化后轉入核內，誘導目的基因表達，轉錄合成 Bcl-2等多種心肌保護因子，介導心肌保護作用[4-5]。當通路被阻斷，Bcl-2蛋白表達下降，Bax蛋白表達增高，激活下游的凋亡效應酶 Caspase-3，使細胞調節、細胞信號轉導、DNA 修復、組織平衡、細胞存活等環節中的重要蛋白水解，從而出現細胞凋亡[6]。Caspase-3作為終端剪切酶，主要于細胞質及細胞核中表達，被稱為細胞凋亡的執行者。

現代藥理研究表明，中藥具有調控心肌細胞凋亡，抗氧自由基損傷，減輕炎癥反應，抑制鈣離子超載等作用[7]。本研究選用具有益氣養陰通絡功效的雙參通脈顆粒，由人參、黃芪、麥冬、當歸、丹參、川芎六味藥物組成。方中人參、黃芪補益元氣，當歸、丹參活血養血，川芎引血上行，麥冬益胃生津，全方散中有補，補而不膩。氣虛則無以行血，陰虛則脈絡不通，氣陰兩虛、心血瘀阻為胸痹心痛病機之一。現有研究表明，人參皂苷Re預處理對急性心肌缺血大鼠心肌有較好的保護作用，該作用可能與激活JAK2/STAT3 通路有關[8]。丹參酮ⅡA 可降低缺血再灌注誘導的大鼠心肌細胞凋亡，其保護機制可能與調節JAK2/STAT3 信號通路有關[9]。丹參可抑制心肌細胞凋亡，其機制與調控BAX、Bcl-2蛋白表達有關[10]。

益氣養陰通絡法能夠抑制急性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡，其機制可能與上調P-STAT3蛋白表達、下調Caspase-3蛋白表達有關。