抗菌肽LL37對脂多糖誘導的大鼠肺泡巨噬細胞炎性損傷的保護作用

施昀 李王平 韓璐瑤 高永恒 王虎 金發光

空軍軍醫大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,西安710038

近年來,由于抗生素的不恰當使用或者濫用已經導致了多種耐藥菌的產生[1],其中致病菌對β-內酰胺類藥物所產生的耐藥性已成為世界性問題[2-3]。抗生素在殺傷細菌的過程中可使脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等致炎因子大量釋放入血,進一步加重對機體免疫系統的破壞。因此,探索一種新的抗菌策略成為目前亟待解決的問題[1]。抗菌肽為一類由生物免疫系統誘導產生的帶正電荷及具備疏水性和雙親性的小分子活性多肽,具有廣譜的抗微生物活性[4-5],是天然免疫系統的重要組成部分。本實驗采用LPS誘導大鼠肺泡巨噬細胞 (NR8383)構建體外炎癥模型,觀察細胞活性及凋亡情況,并檢測腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6 等炎癥因子及核因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)蛋白的表達,進而評價LL37對巨噬細胞的保護效應,探討其抗炎作用的具體分子機制以期從細胞水平理解LL37在炎癥疾病中的應用價值,為臨床合理應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 NR8383細胞購自齊氏生物科技有限公司;DMEM 培養基和胎牛血清購自美國HyClone公司;LPS購自美國Sigma公司;CCK8細胞檢測試劑盒購自東仁化學科技有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒購自碧波生物科技有限公司;TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒購自中國Neobioscience公司;P-NF-κB p65 抗體購自美國Abcam公司;LL37和 LL37中和抗體購自美國Hycult Biotech公司;流式細胞儀為BD Accuri C6(美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組干預 NR8383細胞培養于含10% FBS 的 DMEM 培養基中,37 ℃、5%CO2恒溫培養箱孵育。將細胞隨機分為4 組：對照組給予正常培養液培養12 h,LPS 組給予含1 mg/L LPS的培養液培養12 h,LL37組給予含10 mg/L LL37 的培養液培養12 h,實驗組在1 mg/L LPS刺激的基礎上,同時加入10 mg/L LL37培養12 h,干預組在實驗組基礎上加入10 mg/L的LL37中和抗體。

1.2.2 CCK8測定巨噬細胞活性 取對數生長期NR8383細胞以每孔2×105接種于96孔板中,培養箱中孵育24 h。次日,棄上清,按 “1.2.1”進行分組及給藥處理,每組設置3個復孔,同時設置空白孔,每孔培養液為100μl。37℃孵育12 h后,加入CCK8 10μl,37 ℃繼續孵育4 h后在450 nm處測量吸光度值 (A450 nm)。細胞活力 (%)=(給藥組A450 nm-空白A450 nm)/ (細胞對照組A450 nm-空白A450 nm)×100%。

1.2.3 流式細胞儀測定細胞凋亡 NR8383細胞以1×106接種于6 孔板,培養箱中孵育過夜后,按 “1.2.1”進行分組及給藥處理細胞12 h。將細胞懸液收集到離心管中,1 000 r/min離心3 min,棄上清,加入預冷的PBS 重懸,用300 目濾網過濾后再次離心,棄上清,加入1×Annexin V binding buffer 調整細胞量,加入 Annexin V FITC、PI Solution 各 5 μl 混 勻,37 ℃ 避 光15 min,流式細胞儀檢測。

1.2.4 細胞上清液中炎性因子TNF-α和IL-6檢測 收集各組細胞后以1 000 r/min離心10 min,取細胞上清液。然后按照按試劑盒要求進行實驗步驟,酶標儀檢測樣品450 nm 波長吸光度,繪制標準曲線,根據樣品吸光度值,從標準曲線查得上清液中TNF-α和IL-6水平,每組實驗重復3次。

1.2.5 細胞中蛋白檢測 采用Western blotting法進行檢測。提取各組細胞蛋白質,BCA 法檢測蛋白質濃度并調整蛋白濃度,然后取相同總量的蛋白,上樣到10%的SDS-PAGE 中,電泳,轉膜。待轉膜完畢后,加入5%脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗,4 ℃搖床孵育過夜,TBST 室溫下搖床洗膜3次后加入二抗,室溫孵育30 min,TBST 清洗3次,化學發光,顯影,定影。采用Image J軟件分析電泳條帶灰度值,以目的蛋白與β-actin灰度比值表示目的蛋白的相對表達量,實驗重復3次。

1.2.6 統計學分析 采用Graphpad Prism7統計軟件,計量資料用±s表示。各組數據間比較用One-way ANOVA 法, 兩兩比較采用least significant difference(LSD)法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細胞活性的影響 用1 mg/L LPS處理NR8383細胞12 h,可見LPS組細胞活力下降,細胞數量減少;單獨給予10 mg/L LL37處理細胞,未見對細胞活性有明顯影響;在給予LPS 刺激同時用LL37 干預,LL37可明顯減弱LPS對細胞的毒性作用;同時,LL37中和抗體可部分抑制LL37的作用。見圖1。

圖1 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細胞活性的影響

2.2 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細胞凋亡的影響 用LPS (1 mg/L)處理NR8383細胞12 h,發現LPS組細胞凋亡率增加,實驗組凋亡率減少,LL37中和抗體可抑制LL37 的保護作用,提示LL37能減輕LPS導致的細胞凋亡。見圖2。

2.3 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細胞TNF-α和IL-6分泌水平的影響 與對照組相較,LPS組TNF-α和IL-6分泌水平明顯增加,差異有統計學意義 (P＜0.05);實驗組在 LL37 作用下,TNF-α和IL-6分泌水平均較LPS組有所下降,差異均有統計學意義 (P值均＜0.05);干預組TNF-α和IL-6 分泌水平均較實驗組組有所上升(P＜0.05)。見表1。

2.4 抗菌肽 LL37 對 LPS 致 NR8383 細胞中P-NF-κB p65蛋白表達的影響LPS組細胞中P-NF-κB p65蛋白表達量高于對照組 (P＜0.05);實驗組細胞中P-NF-κB p65蛋白表達量低于LPS 組 (P＜0.05);實驗干預組細胞中P-NF-κB p65蛋白表達高于實驗組 (P＜0.05),提示LL37可降低LPS導致的細胞內P-NF-κB p65蛋白的增高,并且這種作用可被其中和抗體所抑制。見圖3。

圖2 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細胞凋亡的影響

表1 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細胞TNF-α和IL-6分泌水平的影響 (ng/L,±s)

表1 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細胞TNF-α和IL-6分泌水平的影響 (ng/L,±s)

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α;LPS為脂多糖;與對照組比較,a P ＜0.05;與 LPS 組比較,b P ＜0.05;與 LPS+LL37 組比較,c P ＜0.05

組別 TNF-α IL-6對照組 68.01±0.676 45.41±1.385 LL37組 73.86±2.86 50.41±0.661 LPS組 776.8±1.136a 566.8±8.079a LPS+LL37組 476.5±1.234b 366.1±10.63b LPS+LL37+anti-LL37組 524.2±14.76c 480.8±9.057c

3 討論

巨噬細胞活化導致炎癥級聯反應的開始和炎性介質的釋放,是宿主防御致病微生物的關鍵過程,NR8383為大鼠源肺泡巨噬細胞,是研究炎癥反應的常用細胞模型。LPS 作為革蘭陰性細菌壁的主要成分,是一類主要的炎癥因子,可作用于多種宿主細胞如巨噬細胞、中性粒細胞和內皮細胞[6],LPS與免疫細胞表面最主要的受體之一的CD14結合并通過LPS結合蛋白LBP形成LPS-LBP-CD14三聯復合物,作用于Toll樣受體4,從而啟動跨膜信號轉導,發揮致炎效應[7]。CAP-18/LL37 是目前發現的人類唯一的Cathelicidins 家族成員,hCAP18含有140個氨基酸殘基,是中性粒細胞特殊顆粒 (亦稱二級顆粒)中的主要蛋白質[8],CA P18以前體蛋白形式合成后,以非活性成分儲存于顆粒中,受到刺激后,裂解產生它的C-端活性肽,即為LL37[9],多項研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗真菌等多種生物學活性,是機體免疫防御的重要組成部分[10-12],本實驗采用LPS誘導大鼠噬細胞NR8383建立炎癥細胞模型,同時以抗菌肽LL37進行干預,進一步研究并揭示LL37發揮抗炎作用的分子機制。

圖3 抗菌肽LL37對LPS致NR8383細胞中P-NF-κB p65蛋白表達的影響

革蘭陰性菌細胞壁中的LPS可誘導該細胞表達多種炎性因子,其中TNF-α可趨化并激活中性粒細胞,IL-6可誘導T 細胞和B 細胞的分化,放大炎癥反應,從而導致組織細胞損傷[13]。Nagaoka等[14]研究表明,抗菌肽 LL-37 可抑制 LPS 與CD14結合,從而抑制LPS誘導巨噬細胞表達,產生TNF-α。已有研究表明,中和TNF-α可降低肺局部與全身的炎癥反應強度[15],在急性肺損傷時抑制炎癥反應能減輕肺組織細胞的凋亡[16]。本實驗結果亦顯示,LPS刺激后,可導致NR8383細胞活性降低,凋亡增加,并且誘導細胞TNF-α 和IL-6的分泌顯著增多,LL37干預后可保護LPS對細胞的損傷作用,并明顯抑制TNF-α和IL-6分泌的升高趨勢,而且在給予LL37 抗體后可以中和LL37的保護作用。由此可見,LL37 可減少LPS誘導的炎性因子TNF-α和IL-6的產生,具有明顯的抗炎保護作用。

研究表明,LPS與巨噬細胞膜上Toll樣受體4的識別結合,可觸發下游信號街頭蛋白My D88的募集,后者又引起一系列信號級聯反應,激活IκB激酶 (inhibitory kappa B kinase,IKK)或促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)[15]。IKK 使IκB 發生磷酸化并釋放P50/P65,MAPK 會磷酸化下游蛋白激酶和轉錄因子。活化的轉錄因子P50/P65進入到核內與靶基因啟動子或增強子區特異序列結合,發揮轉錄調節功能,產生如TNF-α和IL-6等促炎因子[16]。本實驗中,我們發現LL37可抑制LPS導致的細胞內活化的NF-κB蛋白的表達,提示LL37對細胞的保護作用可能是通過抑制NF-κB 信號通路,進而抑制巨噬細胞分泌、活化TNF-α與IL-6發揮抗炎作用。

綜上所述,抗菌肽LL37可以有效抑制LPS誘導的NR8383細胞炎癥,明顯抑制巨噬細胞促炎癥因子的分泌,發揮良好的抗炎作用。其抗炎機制可能與通過中和LPS,抑制巨噬細胞炎癥通路中PNF-κB p65 蛋白的表達,以減少 TNF-α、IL-6 等相關促炎癥因子分泌有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突