黃芩根漢黃芩苷提取及復合保鮮液在圣女果貯藏中的應用

張曉虎，楊風婷，殷佳琦，肖秦箭

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

0 引言

在食品保鮮劑研究領域已廣泛利用中草藥等植物源中有效保鮮成分研發天然食品保鮮劑。藥用植物黃芩的提取物能夠有效抑制多種細菌生長，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽胞桿菌、沙門氏菌等，從黃芩中提取防腐保鮮物質并用于食品保藏已引起人們關注[1]。

黃芩中的成分極為復雜，主要包括漢黃芩苷等在內的黃酮類物質是其發揮功效的主要活性成分[2～4]。程存歸等[5]采用微波輔助水提或有機溶劑提取的方法研究得出黃芩中黃芩苷的最佳提取工藝；李芳等[6]采用微波輔助乙醇回流聯合方法從黃芩中提取黃芩苷；梁英等[7]采用二次正交旋轉組合試驗研究乙醇回流浸提黃芩黃酮的優化工藝；王雪等[8]采用中心組合設計-響應面法研究黃芩中抗菌有效活性成分優化提取工藝；魏長志[9]研究比較表明黃芩對金黃色葡萄球菌和痢疾桿菌的抗菌活性的影響次于黃連而優于黃柏；霍峰巖等[10]研究了不同濃度黃芩提取物對芒果貯藏保鮮效果的影響。但查閱文獻未見有關針對黃芩根部漢黃芩苷提取物用于食品防腐保鮮的相關研究報道。

研究選取出自秦嶺腹地商洛山區的量大、質優、國內知名的“五大商藥”之一的黃芩[11]，采用微波輔助乙醇浸提法從干燥的黃芩根部提取漢黃芩苷，用分光光度法測定漢黃芩苷的含量；根據單因素實驗結果設計正交試驗，確定最佳提取工藝；做漢黃芩苷抑菌實驗，確定最佳抑菌濃度；制備復合保鮮液并用于圣女果的保鮮貯藏。研究結果將為黃芩中漢黃芩苷作為保鮮成分在果蔬保藏中的應用提供技術參考，促進商洛當地黃芩資源的綜合開發利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 材料：兩年生黃芩根(2017年9月13日采挖于陜西省商洛市商州區商洛學院中草藥種植園)；新鮮圣女果(2018年5月12日采摘于商州區劉灣街道辦事處設施蔬菜棚區)。

試劑：漢黃芩苷標準品，無水乙醇，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，抗壞血酸(Vc)，海藻酸鈉，氯化鈣，酚酞，NaOH溶液，蒸餾水等。

菌種：金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌。

1.1.2 儀器 MDS-6G型多通量微波萃取系統，北京安和美誠科學儀器有限公司；755B型紫外可見分光光度計，上海光學儀器儀器有限公司；SI-234型電子分析天平，奧然科技有限公司；202型電熱恒溫干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；HJH-DNP-9082型恒溫培養箱，廣州航信科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗材料預處理 將完整挖出黃芩的根部洗凈、去其皮及須根，置于烘箱中60℃烘干，高速萬能粉碎機粉碎，過40目篩，置于干燥的廣口瓶內，密封保存備用。

1.2.2 漢黃芩苷標準曲線的制備 稱取漢黃芩苷標準品5 mg，放入50 mL容量瓶中，用50%乙醇定容。用移液管分別移取1、2、3、4、5 mL漢黃芩苷標準品溶液于5個10 mL的容量瓶中，用50%乙醇定容，搖勻，放置10 min，以空白乙醇溶液為對照，用紫外分光光度計在330 nm處測定其吸光度。每個樣品測定3組平行，取平均值。繪制標準曲線見圖1，得到回歸方程y = 13.757x + 0.0076，R2=0.9947，可以此求出漢黃芩苷的含量。

圖1 漢黃芩苷標準曲線

1.2.3 黃芩根漢黃芩苷的提取 精確稱取黃芩根粉末1 g，按一定料液比加定量乙醇，置于微波萃取系統，選擇一定的微波功率進行提取，接受一定的微波輻射時間，待溶劑揮發冷凝回流后，取出冷卻至室溫，重新置于多通量微波萃取系統中，上述步驟重復操作以累計達到設計的總輻射時間值為至。提取完成后過濾，將上清液轉入離心管中，5 400 r·min-1離心15 min獲取上清液，即得黃芩根提取液。

1.2.4 黃芩根漢黃芩苷提取率的測定 吸取黃芩根提取液1 mL，以漢黃芩苷為標準，測定波長330 nm處的吸光度，結合1.2.2線性回歸方程計算提取液中漢黃芩苷提取率，計算公式如下：

W%=[(C×n×V)+M]×100%

式中：C—提取液濃度，mg·mL-1；n—稀釋倍數；V—提取液體積，mL；M—所用黃芩根的質量，mg。

1.2.5 單因素實驗 以黃芩根部漢黃芩苷提取率為指標，研究乙醇體積分數(40、50、60、70、80%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、微波功率(300、400、500、600、700 W)、微波加熱時間(2、4、6、8、10 min)4個因素對黃芩根中漢黃芩苷提取率的影響[12]。

1.2.6 正交試驗設計 依據以上4個考察因素，以漢黃芩苷的提取率為指標，設計4因素3水平的正交試驗[13]。

1.2.7 抑菌效果試驗 研究漢黃芩苷提取液對大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果，確定最低抑菌濃度[14,15]。

1.2.8 復合保鮮液的配制 選用抗壞血酸、海藻酸鈉、氯化鈣、漢黃芩苷提取液作為保鮮液配方的組分，采用不同濃度進行試驗設計，見表1。

1.2.9 保鮮效果試驗 取當日采摘的新鮮圣女果用蒸餾水沖洗干凈，晾干后將配方不同保鮮液噴灑至圣女果上，放置在20℃、相對濕度為70%的培養箱中進行貯藏保鮮，對照空白組用蒸餾水處理，間隔1d取樣測定防腐保鮮效果指標[16,17]。圣女果的感官品質、腐爛率、失重率均用全部果實測定；可滴定有機酸含量測定的圣女果，隨機取樣、破碎、勻漿。試驗均重復3次，取其平均值。

感官品質：觀察圣女果外觀、色澤，測定硬度，評價風味與口感，判斷其優劣狀況。

腐爛率% =(腐爛果實質量/總果實質量)×100 %

失重率% = [(原重-實重)/原重]×100 %

可滴定酸含量：每組稱取圣女果100 g，去掉果皮后勻漿，量取5 mL漿液，蒸餾水定容至50 mL后過濾并收集濾液，酚酞作指示劑，用標準NaOH溶液滴定，以檸檬酸為折算系數，以堿液的耗量計算可滴定酸的含量。同時以蒸餾水做空白對照，此時測定的即為圣女果果肉中有機酸的含量。

表1 漢黃芩苷復合保鮮液配方

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 乙醇體積分數對黃芩根漢黃芩苷提取率的影響 如圖2所示，漢黃芩苷提取率隨乙醇體積分數增加而逐漸增加；達到50%后，漢黃芩苷提取率又迅速下降，結果顯示并非乙醇體積分數越高提取率越高，其作用濃度范圍是一定的。究其原因：一是微波加熱是直接作用于介質分子，乙醇和水都是極性分子，但兩者在結構上有較大差異，須有一定比例關系才能使效果達到最佳。二是雖然乙醇溶液對漢黃芩苷具備良好的溶解性，但在一定濃度范圍內，漢黃芩苷的溶解效果較好。因此，選取50%作為較佳的乙醇體積分數。

2.1.2 料液比對黃芩根漢黃芩苷提取率的影響 如圖3所示，漢黃芩苷的提取率隨著料液比的增加而增加，但在料液比為1∶15之后又開始下降，即當料液比為1∶15時提取率最高。因此，選擇1∶15作為較佳的料液比。

2.1.3 微波功率對黃芩根漢黃芩苷提取率的影響 如圖4所示，在500W微波功率范圍內，隨著微波功率的升高，提取率逐漸增大。功率500W時，提取率達到最大。由此可知，隨著微波功率的增加，黃芩細胞破壞更充分，更多的漢黃芩苷從原料中溶出。因此，選取500W作為最佳的微波功率。

2.1.4 微波加熱時間對黃芩根漢黃芩苷提取率的影響 如圖5所示，漢黃芩苷提取率隨加熱時間推移有所增加，當加熱時間為6 min時，提取率最大。當加熱時間繼續上升時，提取率開始下降，這是因為微波可以瞬間產生大量熱量，溫度過高、加熱時間過長可能會對漢黃芩苷有破壞作用。因此，選取6 min作為最佳加熱時間。

2.2 正交試驗結果與分析

選取乙醇體積分數(A)、料液比(B)、微波加熱時間(C)、微波功率(D)為影響黃芩根漢黃芩苷提取率的因素，黃芩苷的提取率為指標，設計4因素3水平的正交試驗。正交試驗設計及結果見表2。

圖2 乙醇體積分數對黃芩根漢黃芩苷提取率的影響

圖3 料液比對黃芩根漢黃芩苷提取率的影響

圖4 微波功率對黃芩根漢黃芩苷提取率的影響

圖5 微波加熱時間對黃芩根漢黃芩苷提取率的影響

實驗號因素 A乙醇體積分數/%B料液比/(g·mL-1)C微波加熱時間/min D 微波功率/W漢黃芩苷提取率/%11(40)1(1∶10)1(4)1(400) 0.020212(1∶15)2(6)2(500)0.026313(1∶20)3(8)3(600)0.03642(50)123 0.03952231 0.04562312 0.01573(60)132 0.02583213 0.02993321 0.040K10.0820.0840.0640.105K20.0990.1000.1050.066K30.0940.0910.1060.104k10.0270.0280.0210.035k20.0330.0330.0350.022K3 0.031 0.0300.0350.035R 0.017 0.016 0.042 0.039

由表2結果可知，根據極差分析判定對黃芩根漢黃芩苷提取率的影響因素大小依次為：微波加熱時間>微波功率>乙醇體積分數>料液比。由正交試驗結果可得出最佳水平組合為A2B2C3D1。因此，經正交設計優化后的提取條件為乙醇體積分數50%、料液比1∶15、微波加熱時間8 min、微波功率400 W。

2.3 抑菌試驗結果與分析

表3 漢黃芩苷對三種供試菌種的抑菌效果

注：表中“-”表示無菌長出；“+”表示有少量菌落長出；“++”表示有大量菌落長出；“+++”表示培養皿幾乎長滿菌落。

由表3抑菌效果分析可得：金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.20 mg·mL-1；枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏菌最低抑菌濃度為0.50 mg·mL-1。

2.4 保鮮效果試驗結果與分析

2.4.1 感官指標趨勢分析 如圖6所示，隨著保藏時間延長，不同濃度復配保鮮液處理的圣女果的綜合感官評分均為下降趨勢。由實驗可以看出，圣女果經復合保鮮液處理后，綜合感官評分雖下降但圣女果感官出現了不同程度變化，第8組處理對綜合感官評分變化最小，空白對照組綜合感官評分下降最明顯速度最快，說明復合保鮮液能明顯的改善圣女果的感官品質。

2.4.2 腐爛率指標趨勢分析 如圖7所示，隨著保藏時間的延長，圣女果的爛果率呈上升趨勢，且于3 d后大幅上升； 7 d時處理1在抑制圣女果腐爛方面的效果最差，爛果率已經高達39%，而處理8果實的爛果率顯著低于其他處理為22%，空白對照組效果最差。

2.4.3 失重率指標趨勢分析 如圖8所示，隨保藏時間延長，圣女果的失重率隨之增加，其中處理8上升的趨勢最緩慢，7 d時失重率為3.9%，而處理2已經達到7.8%，空白對照組上升迅速，圣女果失水嚴重。從失重率指標可知，最佳復配組合是處理8。

2.4.4 可滴定有機酸趨勢分析 圣女果中的有機酸在貯藏期間，部分通過呼吸作用被消耗，部分在果肉內轉化為糖分。如圖9所示，在貯藏中的酸含量整體呈下降趨勢，第8組處理下降速度稍慢，可見復配保鮮液有效延緩了圣女果貯藏期間可滴定酸含量的下降趨勢，有利于提高圣女果貯藏保鮮效果。

圖6 綜合感官指標隨保藏時間變化趨勢

圖7 腐爛率隨保藏時間變化趨勢

圖8 失重率隨保藏時間變化趨勢

圖9 可滴定有機酸隨保藏時間變化趨勢

3 結論與討論

3.1 結論

以商洛黃芩為研究對象，采用微波輔助乙醇浸提正交試驗的方法優化黃芩根中漢黃芩苷的提取工藝；在漢黃芩苷抑菌實驗的基礎上，制備漢黃芩苷提取物與海藻酸鈉、氯化鈣和抗壞血酸復合保鮮液并用于圣女果保藏，得到以下結論：

(1)基于正交試驗優化取得的漢黃芩苷提取工藝參數為：乙醇體積分數50%、料液比1∶15、微波加熱時間8 min、微波功率400 W。影響提取率的因素大小依次為微波加熱時間>微波功率>乙醇體積分數>料液比。

(2)抑菌實驗表明：當金黃色葡萄球菌中漢黃芩苷的添加濃度超過0.20 mg·mL-1，枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏菌添加濃度超過0.50 mg·mL-1時，表現出抑菌效果。

(3)制備的復合保鮮液最優配方為：海藻酸鈉濃度1.2%、氯化鈣2.0%、抗壞血酸1.5%、漢黃芩苷0.5%；使用該配方能有效改善圣女果貯藏期間的感官品質，抑制失重率及腐爛率的上升，延緩可滴定酸含量下降趨勢，保鮮效果良好。

3.2 討論

(1)研究采用微波輔助乙醇浸提黃芩根漢黃芩苷，微波輔助法能夠破壞植物細胞壁，加速漢黃芩苷溶出，比傳統方法省時省力且安全無污染，利于提高提取率。

(2)研究取得的有關黃芩根中漢黃芩苷提取工藝參數，對漢黃芩苷的抑菌效果及最低抑菌濃度進行初步研究，未對漢黃芩苷進行分離純化處理。結果表明黃芩根漢黃芩苷對大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定抑制效果，試驗結果與黃芩有效抑菌成分的研究結論基本一致[18]。

(3)建議在以后的研究中注意：適宜的微波加熱時間是影響漢黃芩苷提取率的重要因素，因為微波可以瞬間產生大量熱量，溫度升高，加熱時間過長會對漢黃芩苷有破壞作用，因此需控制微波加熱時間，否則會造成有效成分流失，降低漢黃芩苷提取率。