復合酶輔助提取柿葉總黃酮工藝研究

袁秀平,王云云,袁向輝

(楊凌職業技術學院，陜西 楊凌 712100)

柿葉為柿科植物柿(Diospyros kaki L.)的新鮮或干燥葉。柿葉中含有黃酮、鞣質、酚類、香豆素類、揮發油、有機酸以及豐富的維生素C等多種物質[1〗，其中黃酮類化合物是柿葉提取物的主要有效成分，諸如蘆丁、黃芪甙、紫云苷、槲皮素、金絲桃甙等，黃酮類化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、清除自由基等多種藥理活性[2～3],可應用于醫藥、食品、保健品以及化妝品等行業，具有極廣的開發應用前景。柿葉黃酮的提取方法有雙水相萃取法[4]、超聲波提取法[5～7]、大孔樹脂分離法[8]、微波提取法[6]、纖維素酶提取法[9～10]以及超臨界萃取法[11]等，復合酶酶解作用對沙棘和冬棗葉總黃酮提取率均有促進作用[12～13]，但利用復合酶提取柿葉黃酮的工藝研究尚未見報道，以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為提取溶劑探索了植物提取專用復合酶在柿葉總黃酮提取中的作用，考察酶解提取條件對總黃酮提取率的影響，優化提取工藝，為柿葉的深度開發和綜合利用提供技術支持和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柿葉：2018年7月采自楊凌職業技術學院西校區校園內柿樹，柿葉采摘清洗后自然風干，在恒溫干燥箱烘至恒重，其烘制溫度設為60℃ ，時間為3h，用萬能粉碎機將烘干的樣品磨碎，過50目篩備用。

試劑：蘆丁標準品(UV≥98%)，江西佰草源生物科技有限公司；纖維素酶(50 000 IU·g-1)、植物提取專用復合酶(20 000 IU·g-1)，河北格貝達生物科技有限公司；無水乙醇，亞硝酸鈉(NaNO2)、九水合硝酸鋁(Al(NO3)3· 9H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、檸檬酸(C4H2O7· H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4· 2H2O)均為分析純。

1.2 儀器與設備

101-3AB型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；150B搖擺式高速中藥粉碎機，浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DZKW型電熱恒溫水浴鍋，天津市大港區紅杉實驗設備廠；SHZ-D(Ⅲ)型循環水式多用真空泵，鄭州科豐儀器設備有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線繪制 準確稱取蘆丁標準品10.05 mg，用60% 乙醇溶解后定容至50 mL容量瓶中，作為標準品原液。分別準確量取蘆丁標準原液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，先加5% NaNO2溶液1.0 mL，5分鐘后加l0% Al( NO3)3 溶液1.0 mL，再5分鐘后加4% NaOH溶液10 mL，用60%乙醇定容，15 min后，在510 nm波長下測定吸光度，作蘆丁濃度-吸光度標準曲線，得回歸方程為 A =0.0091C+0.0041，R2=0.9996。

1.3.2 酶解法提取單因素影響試驗 粉碎過篩的柿葉粉末為樣品，使用磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液作為提取溶劑，選擇生物酶種類、酶用量、緩沖液pH、酶解溫度和酶解提取時間五個因素，采用固定其它因素，考察單一因素對柿葉黃酮提取率影響的方式順次進行單因素篩選試驗。具體操作方法是：準確稱取柿葉粉1. 00 g 于具塞三角瓶中，加20 mL緩沖液，添加生物酶，在合適溫度水浴條件下酶解一定時間后加25 mL無水乙醇，抽濾，用60%乙醇定容于50 mL，作為待測樣液。

圖1 蘆丁標準曲線

1.3.3 正交試驗法優化提取工藝 綜合單因素試驗結果的分析，選擇對柿葉黃酮提取率影響較大的因素水平進行正交試驗設計，優化酶解法提取柿葉總黃酮的工藝，優選出提取最適條件。

1.3.4 柿葉中總黃酮含量測定和計算 量取樣品待測液 1.0 mL于 25 mL容量瓶中，按1.3.1中方法操作，將所得吸光度代入標準曲線回歸方程，計算得提取液中總黃酮含量。按下列公式計算出總黃酮含量和黃酮提取率：黃酮含量( mg·g-1) = C×25×50 /1 000 W，黃酮提取率/ %= (黃酮含量/1 000)×100%，式中，C為從回歸方程求得的蘆丁濃度(mg·L-1) ，25、50為稀釋倍數，W為柿葉重(g)。

2 結果與分析

2.1 酶解法提取柿葉總黃酮的單因素影響試驗

2.1.1 生物酶種類和用量的影響 試驗中固定提取溶劑為pH4.8的緩沖液，40℃水浴，酶解提取時間為60 min，分別考察纖維素酶和復合酶用量為0、20、40、60、80、100 mg的影響。生物酶種類和用量對柿葉總黃酮提取率影響見圖2。

圖2 酶用量對柿葉總黃酮提取率的影響

由圖2可明顯看出，添加生物酶可提高黃酮提取率，且相同用量的復合酶比單一纖維素酶提取率高，可能是因為復合酶由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和β-葡聚糖酶四種酶組成，生物酶之間可發揮協同促進作用。復合酶用量在6%時，提取率明顯升高，之后的增漲幅度非常?。焕w維素酶隨著用量的增加，黃酮提取率呈遞增趨勢，但是總體提取率仍低于復合酶。

2.1.2 緩沖液pH的影響試驗 試驗時分別添加纖維素酶和復合酶用量固定為60 mg，40℃水浴，酶解提取時間為60 min，考察提取溶劑緩沖液pH值為4.2、4.8、5.4、6.0、6.6、7.2的影響。緩沖液pH對柿葉總黃酮提取率影響見圖3。

圖3 緩沖液pH對柿葉總黃酮提取率的影響

圖3可知，緩沖液pH值的大小對于柿葉總黃酮的提取率影響較大，復合酶在pH5.4～6.0左右黃酮提取率達到5.6%以上，而纖維素酶在pH5.4時，黃酮提取率達最高值5.2%，但還是低于復合酶的促進作用。當pH超過6.0后，兩種酶的促進作用均明顯下降，幾乎失去生物酶的促進作用?？赡苁怯捎趶秃厦钢衅渌M分的原因，其最適pH和纖維素酶的有差異，但表現出緩沖液pH在4.8～6.0的范圍內，酶解法提取黃酮率較高。

2.1.3 酶解溫度的影響試驗 試驗中固定添加了60 mg復合酶，pH6.0的緩沖液作為提取溶劑，分別在30、40、50、60、70℃水浴條件下酶解60 min。酶解提取溫度對黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 溫度對柿葉總黃酮提取率的影響

圖4中得知，隨著溫度升高，總黃酮的提取率隨之升高，當溫度達到 50℃ 時，總黃酮提取率達到5.7%，繼續升溫，總黃酮的提取率急劇下降。可能是因為隨溫度升高，酶活性逐漸增大，提取率升高; 當溫度超過60℃時，酶逐漸失活，總黃酮提取率降低，70℃時，完全喪失酶的活性，黃酮提取率甚至低于不加酶的對照組。

2.1.4 酶解時間的影響試驗 試驗中添加了60mg復合酶，pH6.0的緩沖液作為提取溶劑，水浴溫度50℃條件下，考察酶解提取時間30、60、120和240min時的黃酮提取率，酶解提取時間對柿葉黃酮提取率的影響見圖5。

由圖5 可見，酶解提取剛開始階段，黃酮提取率隨時間延長呈增長趨勢，1 h后，黃酮含量增長幅度變小，2 h后幾乎不再增長，說明酶的活性發揮主要是在60～120 min之間，再延長提取時間反而會影響黃酮提取的純度和組分。

圖5 酶解提取時間對柿葉總黃酮提取率的影響

2.2 正交試驗優化提取工藝

依據單因素試驗結果，以柿葉黃酮提取率為考察指標，選取酶解提取溫度(A)、緩沖液pH值(B)、添加復合酶量(C)和酶解提取時間(D)四因素三水平，按L9(34)設計正交試驗(見表1)。

表1 正交試驗因素水平設計

從正交試驗結果分析(表2)看出，影響因素的主次順序為：pH值>提取溫度>提取時間>酶用量，復合酶輔助提取柿葉總黃酮的最佳工藝條件為為A3B2C2D2，但是該組合并未出現在正交試驗組中，因此進行了驗證試驗，并設不加酶的空白對照。結果顯示，在最優組合條件下，柿葉總黃酮提取率為6.02%，而對照組的黃酮提取率為4.41%。

表2 正交試驗設計及結果分析

3 結論

在單因素試驗研究基礎上，進行正交優化工藝，結果表明添加復合酶比單一的纖維素酶更有助于提高柿葉黃酮的提取率。酶解法提取柿葉黃酮的最佳提取條件是：pH5.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為提取溶劑、復合酶用量為70 mg·g-1、提取溫度為45℃恒溫水浴、提取時間90 min，在該條件下，柿葉黃酮提取率達6.02%，比不加酶的對照組提高了36.5%。 此法具有成本低，得率高的優勢，可為柿葉總黃酮的提取工藝研究和優化提供參考價值。