丹蔞片調控心肌細胞鈣超載的變化及其信號分子機制*

譚亞芳 梁瑋婷 潘文君 祁建勇 張敏州△

（1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東 廣州 510120）；2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州510006）

據國家心血管病中心最近發布的報告顯示，心血管病占居民疾病死亡構成的40%以上，為我國居民的首位死因，其中冠心病死亡率在逐年上升。心肌缺血再灌注損傷是個復雜的病理過程，與氧自由基、鈣超載、能量代謝障礙等密切相關［1-2］。鈣超載是心肌細胞損傷和死亡的共同通路［3］，故防治鈣超載是阻止心肌缺血再灌注損傷的重要舉措。“鈣超載”是心肌細胞電重構的關鍵，也可能是心肌缺血發生并持續的重要基礎。丹蔞片是痰瘀同治法的代表方藥，由瓜蔞皮、薤白、丹參、赤芍等10味中藥組成，諸藥合用，攻補兼施，瀉實補虛，標本兼治，具有寬胸通陽、活血化瘀、化痰散結的功效。臨床上主要用于治療心血管類疾病，如心絞痛、急性心肌梗死等［4］，對高脂血癥、穩定型心絞痛、支架植入術后患者及非血運重建急性冠脈綜合征患者均有確切的療效［5］，而且還可以抑制炎癥反應，起到穩定斑塊及抗氧化的作用［6］。本課題組采用連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）建立大鼠心肌細胞的缺氧模型，運用激光共聚焦檢測Na2S2O4對心肌細胞內鈣離子濃度的影響，在此基礎上觀察丹蔞片，鈣調蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）抑制劑KN93對大鼠心肌細胞鈣負荷的影響，并對細胞CaMKⅡ及磷酸化鈣調蛋白依賴性激酶（P-CaMKⅡ）的變化進行檢測，其目的旨在進一步探討丹蔞片、細胞鈣超載和CaMKⅡ三者之間的關系，有助于闡明丹蔞片對心肌缺血保護作用的確切機理，并為今后研究DLT防治心肌缺血再灌注損傷的可行性奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物與儀器 丹蔞片超微粉（吉林康乃爾，國藥準字 Z20050244）， 連二亞硫酸鈉（Na2S2O4，Sigma），p-CaMKⅡ及CaMKⅡ抗體均購自美國CST公司，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Saline，PBS）、高糖培養基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、雙抗（HyClone）。 垂直電泳槽（Bio-rad），酶標儀（Biotek），凝膠成像系統（Biorad），高速冷凍離心機（Bio-rad）

1.2 細胞株 大鼠心肌細胞株H9c2（中山大學實驗動物中心提供）。H9c2心肌細胞株來源于大鼠胚胎期心臟組織，在37℃、5%CO2的條件下，培養于含有10%胎牛血清或者10%含藥血清的DMEM培養基中。

1.3 心肌細胞缺氧模型制備 采用加入Na2S2O4的方法模擬缺氧環境，取Na2S2O4粉末45.45 mg溶解于2.611 mL磷酸鹽緩沖液中，充分溶解，配制成100 mmol/L的Na2S2O4溶液作為儲備液，現配現用。將生長狀態良好的H9c2細胞均勻種至60 mm細胞培養皿中，并設空白對照組正常培養，2 h后去掉培養基，收集細胞及其上清液，進行相關檢測及研究。

1.4 細胞存活率檢測 為了得到制備心肌缺氧模型的最佳濃度，我們采用MTT法對加入不同濃度連二亞硫酸鈉后細胞存活率的影響進行比較。方案如下：將生長狀態良好的H9c2細胞以5×104個/mL均勻種至96孔板，設置連二亞硫酸鈉的最終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L，給藥分組及劑量如表1所示，并設空白對照組正常培養。H9c2細胞37℃孵育24 h，每組 6 個副孔。 藥物處理 24 h、48 h、72 h 后，每孔加入 5 g/L LMTT 溶液（PBS 配制）15 μL（溶液體積的 10%），37 ℃孵育 4 h，棄培養基，每孔加入 150 μL DMSO，振蕩10 min，490 nm測定各孔OD值。以正常組OD值為對照，取6孔均值按公式計算細胞抑制率（%）＝（OD 對照組-OD 實驗組）/（OD 對照組-OD 空白組）×100%。

1.5 丹蔞片含藥血清的制備 選取雄性健康SD大鼠20只，隨機分為丹蔞片給藥（DLT）5 g/kg組10只，生理鹽水組10只。取丹蔞片超微粉150 g溶解于100 mL生理鹽水，攪拌均勻，充分溶解，配制成5 g/kg的丹蔞片混懸液。將SD大鼠稱體質量，丹蔞片給藥組按5 g/kg體質量灌胃丹蔞片混懸液，生理鹽水組為空白對照組，不灌胃藥液，只根據體質量灌胃生理鹽水，連續灌胃10 d后取材，以7%水合氯醛于SD大鼠左下腹進行腹腔注射，麻醉大鼠，稱量大鼠體質量，腹主動脈取血，將血液于常溫靜置2 h后，2 500 r/min離心5 min取上層血清，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置于-80℃冰箱保存備用。

1.6 細胞分組與處理 通過實驗確定最佳造模濃度后，進行進一步的機制研究。方案如下：將生長狀態良好的H9c2細胞均勻種至60 mm細胞培養皿中，實驗分組設置空白對照 （正常培養，無處理）組、模型（Na2S2O4）5 mmol/L 組、抑制劑（KN-93+Na2S2O4）組和給藥（DLT+Na2S2O4）組，其中給藥組用含 10%丹蔞片含藥血清的高糖培養基培養24 h、抑制劑組用對應通路抑制劑處理2 h后，分別加入連二亞硫酸鈉（終濃度5 mmol/L）缺氧2 h造模，每組設置平行3組，缺氧結束后去掉培養基，加入DMEM培養基正常培養進行復氧1 h。操作結束后進行相關檢測及研究。

表2 實驗分組及劑量

1.7 激光共聚焦檢測鈣離子濃度 用HBSS溶液稀釋 1～5 mmol/L 的 Fluo 4-AM 母液，配制成 1～5 μmol/L的Fluo 4-AM工作液；取出預培養的細胞，除去培養基，使用HBSS溶液洗滌細胞3次；加入Fluo 4-AM工作液，溶液量以覆蓋細胞為準；37℃細胞培養箱孵育10～60 min，除去Fluo 4-AM 工作液；用 HBSS溶液洗滌細胞3次，以充分去除殘留的Fluo 4-AM工作液。然后加入HBSS溶液覆蓋細胞；37℃培養箱孵育約20～30 min，以確保AM體在細胞內的完全去酯化作用；用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測細胞，將細胞板中的蓋玻片取出，放在激光掃描共聚焦顯微鏡載物臺上，先用光學顯微系統，初步調節焦平面，選擇狀態良好的心肌細胞，用氮氫離子激光預掃描，激發波長494 nm，發射波長516 nm，調節掃描范圍、掃描參數掃描方式、光闌大小、掃描速度、采樣點數、增益、焦平面使熒光圖像清晰、層次明顯。

1.8 蛋白免疫印跡法測定細胞裂解液中蛋白濃度將生長狀態良好的H9c2細胞均勻種至六孔板中，藥物作用后，棄培養基，用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液冰上裂解細胞，提取細胞蛋白。BCA法測定細胞裂解液中蛋白濃度，計算上樣體積。蛋白上樣，用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h，加入相應稀釋比例的第一抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后，更換二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜，ECL發光液處理，化學發光成像儀檢測，分析相關蛋白的表達情況。

2 結 果

2.1 不同濃度下細胞形態學觀察結果 倒置顯微鏡下觀察發現，正常H9c2心肌細胞培養2～3 d后，胞體飽滿富有立體感，呈長梭形，邊界清晰，折光性好，細胞單層貼壁，互不重疊。加入Na2S2O4損傷后引起細胞形態學發生改變，在Na2S2O4（40 mmol/L）作用2 h后尤其明顯，表現為缺氧模型組細胞膜皺縮，細胞體積縮小變圓，細胞無法正常貼壁，大面積脫落，成片漂浮于上清液中，胞體折光性下降，呈碎裂崩解壞死表現。其余給藥濃度細胞形態變化不明顯。見圖1，圖2。

圖1 濃度梯度Na2S2O4造模2 h后（4倍）

圖2 濃度梯度Na2S2O4造模2 h后（10倍）

2.2 各組細胞存活率檢測結果 分別加入0.625～40 mmol/L Na2S2O4作用 H9c2 細胞 24、48、72 h 后，各組模型組與對照組相比細胞抑制率均顯著上升 （P<0.01），并呈濃度依賴性升高。24 h 時，0.625～10 mmol/L Na2S2O4對細胞生長抑制作用梯度變化顯著，而10～40 mmol/L Na2S2O4對細胞生長抑制作用變化不明顯，幾乎達到最大值 90%～95%；48 h時，0.625～2.5 mmol/L Na2S2O4對細胞生長抑制作用梯度變化顯著，而2.5～40 mmol/L Na2S2O4對細胞生長抑制作用變化不明顯，幾乎達到最大值 86%～95%；72 h時，0.625、1.25 mmol/L Na2S2O4對細胞生長抑制作用梯度變化顯著，而1.25～40 mmol/L Na2S2O4對細胞生長抑制作用變化不明顯，幾乎達到最大值86%～95%。由此可知，在24 h Na2S2O4（10 mmol/L）、48 h Na2S2O4（2.5 mmol/L）、72 h Na2S2O4（1.25 mmol/L）時可達到最大對細胞生長抑制作用（P<0.001）。從對細胞生長抑制作用效果好、重復性好、節省實驗材料等角度綜合考慮，故選擇5 mmol/L Na2S2O4參與H9c2心肌細胞缺氧模型的建立。見表3、圖3。

表3 Na2S2O4對心肌細胞抑制率影響時效、量效表

圖3 不同濃度Na2S2O4對心肌細胞活性影響時效、量效圖

2.3 激光共聚焦結果 結果如圖4、5所示，未經連二亞硫酸鈉處理的對照組心肌細胞，經Fluo-4染色后在激發光激發下發出較弱的綠色熒光，而經僅連二亞硫酸鈉處理的模型組心肌細胞，經Fluo-4染色后在激發光激發下發出較強的綠色熒光，心肌細胞缺氧、復氧后，胞漿內鈣離子濃度顯著增高，說明形成心肌細胞鈣超載損傷，與模型組相比，抑制劑組及丹蔞片組的熒光強度相對減弱，兩組均能減輕H9c2細胞內鈣超載的情況。

圖4 各組心肌細胞鈣離子濃度（Fluo-4染色，200倍）

圖5 各組心肌細胞熒光強度值

2.4 蛋白免疫印跡結果 所示分組并干預后，結果見表4、圖6，與對照組相比，模型組能升高p-CaMKⅡ的表達，證明模型組能夠顯著促進心肌細胞形成鈣超載損傷，造模成功。而與模型組相比，給藥組及抑制劑組均能顯著降低p-CaMKⅡ的表達，證明給藥組能夠顯著抑制心肌細胞鈣超載。由此可知，通過調節p-CaMKⅡ蛋白的表達，丹蔞片能夠抑制心肌細胞鈣超載（P<0.001），減少心肌細胞損傷，發揮其對心肌缺血的保護作用。

表4 各組心肌細胞p-CaMKⅡ/CaMKⅡ灰度比值

圖6 各組心肌細胞p-CaMKⅡ、CaMKⅡ蛋白電泳條帶

3 討 論

心肌遭受缺血再灌注后，參與細胞內鈣循環的L-型電壓依賴鈣通道 （L-VDCC）、肌漿網鈣ATP酶2a（SERCA2a）和受磷蛋白（PLB）、Ryanodine 受體 2（RyR2）、Na+/Ca2+交換體、Na+/H+交換體等多種蛋白功能異常，導致舒張期［Ca2+］i上升，鈣瞬變幅度降低，細胞出現鈣超載［7］。

肌漿網鈣ATP酶2a（SERCA2a）是鈣穩態的主要調節因子［8］。其功能是在舒張期重攝Ca2+進入肌漿網，以維持細胞內Ca2+穩態，調節心肌興奮-收縮耦聯［9］。受磷蛋白（PLB）是SERCA2a的主要調節因子，PLB和SERCA2a的相互作用，調節其對鈣離子的親和力。未磷酸化的PLB抑制SERCA2a鈣離子的親和力，PKA或CaMKⅡ磷酸化的PLB對SERCA2a的抑制作用減弱，增強肌漿網（SR）鈣重攝取［10］。 在慢性缺氧導致的心衰大鼠中，CaMKⅡ合成可以代償性增加，可一定程度上維持心功能。阻滯家兔心肌細胞中CaMKⅡ可以抑制異丙腎上腺素誘導產生的鈣滲漏最終提高心肌細胞的收縮力。鈣超載、酸中毒、活性氧（ROS）生成過多、炎癥反應等多種機制可導致心臟功能失調，在器官水平上表現為心律失常、心肌梗死、心肌頓抑、無復流現象，其中鈣超載作為最主要的心肌損傷機制而備受關注，針對鈣超載機制與對抗措施的研究一直是關注熱點［11-12］。多數研究者認為缺血再灌注過程中，Na+/Ca2+交換體活性增加是導致鈣超載的主要原因［13-14］。CaMKⅡ作為Ca2+/CaM調節蛋白家族中的一個主要成員，其在細胞的病理生理過程中發揮著重要的生物學作用。

心肌缺血是多種心臟疾患的初始階段。中醫理論認為，“氣虛血瘀”是心肌缺血再灌注損傷重要的中醫病機。近年來，中藥在心血管疾病的預防及治療中占據重要地位，目前研究發現，中藥對抗心肌缺血機制的研究角度主要有：抑制細胞凋亡、清除自由基、抑制鈣超載、促進血管新生、抑制炎癥損傷等［15］。丹蔞片是以中醫經典名方為基礎的純植物藥制劑。研究表明，丹蔞片能明顯縮小冠心病痰瘀互結證大鼠的心肌梗死面積，降低心肌三酶活性，減輕心肌組織和心肌細胞病理損傷，對心肌缺血具有明顯的保護作用，其機制可能與改善冠心病（痰瘀互結證）時血液高黏滯狀態、血脂代謝紊亂以及抑制心肌細胞凋亡有關［16］。

本研究通過前期預實驗，確定采用5 mmol/L Na2S2O4缺氧處理2 h以建立穩定的心肌細胞缺氧損傷模型，且能誘導H9c2細胞內鈣離子平均熒光強度顯著升高，細胞損傷程度適中。而抑制劑組能顯著減輕H9c2細胞內鈣超載，丹蔞片組能減輕H9c2細胞內鈣超載。此外，在機制實驗中，發現與模型組相比，丹蔞片給藥組能顯著降低p-CaMKⅡ的蛋白水平；提示丹蔞片通過調節p-CaMKⅡ信號通路，抑制鈣超載，發揮其對心肌缺血的保護作用。Ca2+/CaM依賴的CaMKⅡ信號轉導在心臟活動中具有重要作用，通過對CaMKⅡ活性及表達的抑制有可能不同程度地減少心肌缺血的形成，降低惡性室性心律失常的發生，甚至猝死。對CaMKⅡ信號轉導途徑的進一步研究不僅有助于探討心肌缺血的始動因素及發生機理，也將為心肌缺血的防治提供新的思路，有著重要的理論意義與潛在的臨床應用價值。