溫下健脾法對膿毒癥胃腸功能障礙大鼠腸道菌群及腸道免疫的影響*

劉 錦 郭 楠 徐亞文 劉福生

（1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京中醫(yī)藥大學膿毒癥研究所，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078）

膿毒癥（sepsis）是指由感染引起的宿主反應失調(diào)導致的器官功能障礙；多器官功能障礙膿毒癥死亡的重要原因［1］。不僅在發(fā)達國家，還是在老齡化的發(fā)展中國家均是嚴重的公共衛(wèi)生問題［2］。在我國面臨全面人口老齡化的國情背景下，膿毒癥的情況更為突出。胃腸功能障礙在膿毒癥患者非常普遍，對膿毒癥患者的預后具有重要意義［3］。西醫(yī)治療膿毒癥胃腸功能障礙的基本方法為抑制胃酸、盡早腸內(nèi)營養(yǎng)、補充腸道益生菌、促進胃腸動力、補充微量元素等，臨床療效有待進一步提高［4］。膿毒癥胃腸功能障礙屬于中醫(yī)脾胃功能的范疇，病機為本虛標實證，扶正與祛邪并舉的治療方案有助于降低膿毒癥患者的病死率［5-6］。中醫(yī)藥防治膿毒癥胃腸功能障礙具有一定的優(yōu)勢［7］。攻下法是在治療膿毒癥胃腸功能障礙中發(fā)揮了重要作用；同時應強調(diào)顧護脾胃，不可一味攻伐，避免損傷脾胃［8］。臨床觀察及研究表明溫下法可以降低膿毒癥患者的死亡率［9］。基于膿毒癥胃腸功能障礙大鼠模型，本研究觀察溫下健脾法治療膿毒癥胃腸功能障礙的療效，進一步探討溫下健脾法對膿毒癥胃腸功能障礙腸道菌群及腸道免疫的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～230 g，購買于北京維通利華實驗動物科技有限公司［許可證號SCXK（京）2016-0006］，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物中心屏障動物飼養(yǎng)室 ［許可證號SYXK（京）2014-0008］，按屏障環(huán)境內(nèi)動物實驗觀察與操作規(guī)范進行實驗。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：大黃附子湯加味由生大黃9 g，炮附子 15 g，細辛 3 g，生黃芪 20 g，黨參 20 g，姜黃9 g，炙甘草10 g組成，購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司并提供質(zhì)量控制檢測。2）儀器：離心機，微量移液器及酶標儀（Thermo Scientific，USA），顯微鏡（OLYMPUS U-CMAD-2），圖像采集系統(tǒng)（Nikon DS-Fi2）；sIgA 試劑盒 （Lifespan，USA，LSF28068），D-乳酸檢測試劑盒（BlueGene，E09D0015）；移液器吸頭（10 μL 及 200 μL），解剖剪，縫合線，液氮，超低溫冰箱，碘酒，甲醛溶液，凍存管及采血管，乳膠手套，濾紙購自北京百諾威生物科技有限公司。

1.3 造模及分組 采用盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）復制大鼠膿毒癥模型，造模方法及模型判定方法同前［10］。對造模成功的24只大鼠隨機分為模型對照組和中藥組各12只，并以10只大鼠行假手術(shù)（麻醉后僅對大鼠行開腹手術(shù)，找到盲腸，但未行結(jié)扎或穿孔。）作為正常對照組。

1.4 干預方法 造模成功后各組大鼠均禁食不禁水飼養(yǎng)。中藥組大鼠術(shù)前及術(shù)后24 h給予大黃附子湯加味中藥（4 mg/g，2次/24 h）灌胃，模型對照組和中藥組予等量滅菌注射用水灌胃。給藥24 h后4%水合氯醛麻醉后取材。

1.5 取材方法 麻醉前強迫大鼠排便至凍存管中，快速將糞便保存-80℃以待測定；麻醉后腹主動脈取全血，離心后分裝-80℃以待測定；分離腸系膜，剪取上端至幽門，下端至回盲部的腸管；剪取距盲腸根部小腸2 cm，剪開腸管，取糞便保存-80℃以待測定；使用生理鹽水沖洗干凈腸內(nèi)容物后放入凍存管-80℃以待測定。

1.6 觀察指標 1）大鼠腸道菌群的測定：取大鼠降結(jié)腸及直腸糞便，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。根據(jù)16S rDNA的測序結(jié)果，使用的UPARSE軟件version 7.1，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋。16S rDNA測序分析數(shù)據(jù)采用I-Sanger云平臺完成了數(shù)據(jù)分析。2）大鼠腸道黏膜分泌型免疫球蛋白（sIgA）及血清D-乳酸的表達水平測定：大鼠腸道黏膜sIgA檢測通過腸道組織裂解、蛋白抽提，釆用ELLISA試劑盒測定，按照試劑盒說明的各項步驟進行檢測。血清D-乳酸的表達水平采用ELISA方法，根據(jù)試劑盒說明的各項步驟進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間對比采用One Way ANOVA檢驗；計數(shù)資料采用率或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠生存率比較 見表1。正常對照組大鼠無死亡；造模成功治療24 h后模型組大鼠死亡率低于模型組（P＜0.05），提示溫下健脾法可以降低CLP膿毒大鼠的死亡率。

表1 各組大鼠生存率比較（n）

2.2 各組大鼠腸道菌群比較 組間腸道菌群的對比采用16S rDNA測序分析得到了766個OUT，13個門，21個綱，30個目，52個科，141個屬，282個種。擬桿菌綱（Bacteroidetes）生活在人或者動物的腸道中，種類很多，屬于條件致病菌。在腸道菌群物種豐度方面，Bacteroidetes表達水平在模型對照組 （24.36±7.15）＜正常對照組（45.20±6.05）＜中藥組（49.69±7.98）（P＜0.05，見圖1A-B，表2）。變形菌門（Proteobacteria）包括很多病原菌（如大腸桿菌、沙門氏菌等）。Proteobacteria表達量在模型對照組和中藥組明顯高于正常對照組，提示Proteobacteria可能是CLP膿毒癥大鼠的特征致病菌；中藥組Proteobacteria表達量低于模型對照組 （見圖1A-B），進一步采用PCoA分析，結(jié)果提示正常對照組和中藥組差異小于正常對照組與模型對照組的差異（見圖1C），以上結(jié)果表明溫下健脾法溫下健脾法調(diào)整CLP膿毒大鼠腸道菌群的紊亂。

圖1 不同組間大鼠腸道菌群的差異

表2 各組主要腸道菌群組成比較（%，±s）

表2 各組主要腸道菌群組成比較（%，±s）

組 別 n Proteobacteria Firmicutes Bacteroidetes正常對照組 10 4.09±2.14模型對照組 12 10.03±7.55 52.91±5.36 45.20±6.05 54.26±26.94 24.36±7.15▲中藥組 12 5.72±4.16 43.61±9.23 49.69±7.98△▲

2.3 各組大鼠腸黏膜sIgA及血清D-乳酸比較 見表3。CLP模型組大鼠腸黏膜sIgA的表達水平低于中藥組及正常對照組（P＜0.05），中藥組大鼠腸黏膜sIgA的表達水平稍低于正常對照組，組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。血清D-乳酸的水平在正常對照組＜中藥組＜模型組（P＜0.05）。結(jié)果表明溫下健脾法可以提高CLP膿毒癥大鼠腸道黏膜sIgA的表達水平，降低血清D-乳酸的水平。

表3 各組腸道黏膜sIgA及血清D-乳酸的比較（μg/mL，±s）

組 別 n 腸道黏膜sIgA 血清D-乳酸正常對照組 10模型對照組 12 26.27±2.05 7.90±0.69 11.57±0.31▲ 12.16±0.75▲中藥組 12 21.25±7.41△ 9.20±0.56△▲

3 討 論

膿毒癥炎癥介質(zhì)大量釋放導致毛細血管滲漏及血管舒縮障礙都會累及胃腸功能及正常腸道黏膜屏障。正常黏膜功能受損引起腸道細菌移位及內(nèi)毒素入血，從而加重膿毒癥的進展［11］。胃腸功能紊亂已成為判斷MODS患者預后的一個重要條件［12-13］。西醫(yī)治療膿毒癥胃腸功能障礙優(yōu)勢在于提供腸道營養(yǎng)、抑制胃酸及補充益生菌、微量元素等。膿毒癥胃腸功能障礙屬脾胃范疇，脾胃主運化功能與腸道屏障及腸道菌群密切相關(guān)，二者在消化吸收、生長發(fā)育、抗御外邪等方面起重要作用。中醫(yī)藥治療膿毒癥胃腸功能障礙的優(yōu)勢在于調(diào)整機體及胃腸功能。膿毒癥胃腸功能障礙患者往往存在正氣不足，若單純使用輔助正氣容易助邪、單用祛邪容易傷及正氣［8］。

大黃附子湯加減為代表的溫下法治療危重癥胃腸功能障礙切中病機［14］，能改善膿毒癥患者炎癥狀態(tài)和胃腸功能障礙、降低死亡率［15］。本研究從免疫屏障及生物屏障的角度研究溫下健脾法調(diào)節(jié)膿毒癥導致的腸道屏障損傷。本研究以CLP誘導膿毒癥大鼠為載體，該動物模型具有膿毒癥胃腸功能障礙的特點。在溫下劑的代表方大黃附子湯的基礎(chǔ)上增加黨參、生黃芪等健脾藥物，觀察溫下健脾法治療膿毒癥胃腸功能障礙的療效及對腸道微菌群及腸道黏膜免疫的影響。大黃附子湯出自《金匱要略》，由大黃、附子、細辛3味藥物組成，既有大黃通里攻下以祛邪，又有附子、細辛溫里散寒以扶正。大黃清熱通腑、活血解毒，附子溫陽祛寒，大黃藉附子之大熱，其寒性去而走瀉之性存，是治療膿毒癥胃腸功能障礙的有效中藥［16］；細辛辛散溫通、宣通陽氣；黨參、生黃芪益氣健脾。正常腸道黏膜屏障由機械屏障、化學屏障、免疫屏障與生物屏障共同構(gòu)成。本研究側(cè)重于評價溫下健脾法對膿毒癥生物屏障及免疫屏障的影響。腸道微生態(tài)平衡和人體健康息息相關(guān)，可以與腸道相關(guān)淋巴組織產(chǎn)生的特異性sIgA進入腸道能選擇性阻礙革蘭氏陰性菌與上皮細胞受體相結(jié)合，同時刺激腸道黏液分泌并加速黏液層的流動，可有效地阻止細菌對腸黏膜的黏附，形成免疫屏障。D-乳酸主要來源于胃腸道細菌的酵解，在重癥感染患者早期即升高，可以反映腸道通透性且可預測感染性休克的發(fā)生，感染、缺血和創(chuàng)傷性休克引起腸道功能障礙均能導致血中D-乳酸濃度的升高［17］。本研究綜合病死率、腸道菌群、腸道黏膜免疫、D-乳酸作為評價溫下健脾法治療膿毒癥的療效和機制指標。

本研究結(jié)果表明溫下健脾法可以調(diào)整膿毒癥引起的腸道Bacteroidetes的降低和Proteobacteria的升高；改善腸道黏膜免疫，降低腸道通透性；從而降低膿毒癥大鼠的死亡率。這與大黃附子湯可減輕失血性休克復蘇后腸道黏膜屏障損傷的報道相一致［18］。本研究是在大黃附子湯加味對膿毒癥胃腸功能障礙的小腸運動、腸道機械屏障［10］的基礎(chǔ)上，結(jié)合健脾類中藥有助于調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂［19］,進一步探討溫下健脾法對膿毒癥胃腸功能障礙腸道免疫屏障及生物屏障的作用。本研究的創(chuàng)新在于采用溫下法聯(lián)合健脾法治療膿毒癥胃腸功能障礙，腸道菌群的對比采用16S rDNA測序分析，明確了溫下健脾法可以調(diào)節(jié)腸道菌群，但溫下健脾法調(diào)節(jié)膿毒癥胃腸功能障礙腸道菌群的具體機制有待進一步研究。

綜上所述，溫下健脾法可以降低膿毒癥胃腸功能障礙的死亡率，調(diào)節(jié)膿毒癥引起的菌群紊亂和腸道免疫異常，改善腸黏膜通透性，從而發(fā)揮治療膿毒癥的作用。