基于多肽陣列技術探討芪歸銀方對多重耐藥銅綠假單胞菌感染大鼠的干預作用*

孔令博 李艷鵬 王冬梅 姚新穎 王輝軍 楊雪冬劉佳瑩 田 莉 孟昭莉 韓 強 劉清泉

（1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；2.首都醫科大學附屬北京友誼醫院新華醫院，北京 101149；3.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010）

近年來，隨著超廣譜抗生素在臨床上的廣泛應用，對β-內酰胺酶類和碳青霉烯類抗生素耐藥的多重耐藥菌株和泛耐藥菌株的檢出率不斷增高［1］。耐藥菌株對人類健康的威脅及其所導致的經濟成本急劇攀升［2］。以銅綠假單胞菌為例，據2015年至2017年中國細菌耐藥性監測（CHINET）數據顯示，銅綠假單胞菌中泛耐藥株的檢出率呈上升趨勢，對亞胺培南和美羅培南的耐藥形勢尤為堪憂［3-5］。由于銅綠假單胞菌耐藥機制十分復雜，臨床治療非常棘手［6-8］。基于中藥復方具有多途徑、多靶點的優勢，前期研究以多重耐藥銅綠假單胞菌為研究對象，切合耐藥菌感染 “正虛邪侵，熱毒內伏”的中醫病機特點創制了芪歸銀方，并證實了芪歸銀方對機體淋巴細胞增殖的干預作用［9-11］。有鑒于此，本實驗利用多肽陣列技術從蛋白質組學水平對芪歸銀方調控多重耐藥銅綠假單胞菌感染大鼠免疫功能的作用機制開展了進一步探索。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 芪歸銀方（黃芪60 g，金銀花15 g，當歸15 g，青蒿 10 g，虎杖 10 g）提取物（1.0 g/mL），由北京中醫藥大學中藥學院中藥研究室提供；注射用頭孢他啶，由深圳致君制藥有限公司生產，產品批號E20100102。按照70 kg成人用量的6.3倍計算大鼠的給藥劑量。

1.2 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠36只，體質量200～220 g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，合格證號SCXK（軍）2007-004。正常光照條件下，食、水可自由攝取，室溫控制在18～22℃之間。

1.3 菌株 多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株1643號，由首都醫科大學附屬北京朝陽醫院細菌室提供。

1.4 試劑與儀器 M-H瓊脂平板購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司（批號：XWO1100301），立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（ASTELL公司，型號：AMA440N），恒溫培養箱（SAMYO 公司，型號：SIM-F124），渦混合器 （Scientific Industries公司， 型號：VORTEX-GENIE 2），低溫高速離心機（上海愛丁堡生物科技發展有限公司，型號：Kendro Labofuge 400R），微量天平（METTLER公司，型號：AE100），酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司，型號：DNM-9602），AutoSpot peptide synthesizer多肽合成儀（CEM 公司，型號：Liberty Lite），數字成像分析儀 （華瑞同康生物技術有限公司，型號：FX-7）。

1.5 菌懸液制備 將實驗菌株接種于M-H瓊脂培養基活化，經37℃恒溫培養18～24 h后，用生理鹽水洗脫菌落，3 000 r/min離心20 min，棄去上清，加入生理鹽水，混勻后吸出0.5 mL加入新的無菌試管中，加入適量生理鹽水，與比濁計進行比濁，將菌液稀釋成24×108CFU/mL，用酶標儀檢測 OD 值為（0.675±0.005），再將其稀釋成0.48×108CFU/mL，作為實驗菌懸液。

1.6 模型制備 SD大鼠常規飼養1周，室溫控制在18～22℃之間，自由獲取食、水，采血前禁食過夜。按照楊鈞等報道的方法建立多重耐藥銅綠假單胞菌腹腔感染大鼠模型［12］。具體方法如下：將多重耐藥銅綠假單胞菌菌液（以下簡稱菌液）同2.0%西黃芪膠1∶1混合后，腹腔注射。注射后自由進食、飲水。

1.7 分組與給藥 雄性SD大鼠36只，采用隨機數字表法分為空白組、模型組、芪歸銀方組，共3組，每組各12只。模型組腹腔注射菌液后（5 mL/kg），即給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，每次2 mL，每日1次。扶正透邪方最佳劑量組腹腔注射菌液后（5 mL/kg），即給予扶正透邪方提取物（0.99 g/mL）灌胃，每次2 mL，每日1次。7 d后留取以上各組大鼠血清標本，進行多肽陣列檢測。

1.8 檢測方法 1）多肽陣列合成。選擇銅綠假單胞菌耐藥蛋白序列中的金屬酶VIM-1（CAG23926）、SPM-1（AAR15341）和超廣譜內酰胺酶（TEMs/ESBLs）TEM（ABB76656）3種蛋白質，進行多肽陣列制作。 （1）配置封閉液Ⅰ：選取 2%（v/v）aceticanhydride in DMF。封閉液 Ⅱ ：2% （v/v） acetic anhydride+2% （v/v） DIPEAin DMF，0.3 mol/L Fmoc-氨基酸溶液，去保護溶液［20%（v/v） piperidine in DMF］。 （2）把活化的 PEG-纖維素膜放置在Autospotter上，再根據程序將 30 μL的Fmoc-氨基酸溶液自動移液到活化的PEG-纖維素膜上的特定位置，并與膜進行2次反應、每次20 min。（3）把PEG-纖維素膜按照順序浸入到封閉液Ⅰ中（反應時間5 min）和封閉液Ⅱ中（反應時間20 min），之后進行側鏈封閉，再進行DMF清洗4次，每次30 s。（4）加入去保護溶液中，2次，每次5 min，用于移除氨基端的Fmoc保護基團。（5）在去保護之后，用DMF清洗3次，每次30 s，然后用乙醇干燥。（6）完成全部合成后，用TFAcocktail將側鏈保護基團去除，再用CH2Cl2清洗4次，然后用乙醇干燥，-20℃保存，用于下一步免疫反應實驗。每張多肽陣列橫向為12個多肽點，縱向為8個多肽點。2）多肽陣列與血清免疫反應。（1）封閉：4%skim milk+5%sucrose in TBST buffer， 室溫 4 h。（2）一抗孵育：對血清進行1∶200稀釋；然后與多肽陣列反應，在4℃下過夜。（3）洗膜：用TBST buffer進行漂洗，漂洗 3次、每次 10 min。 （4）二抗孵育：二抗（羊抗人）IgG-HRP， 用封閉液進行 1∶1 000 或 1∶2 000 稀釋，在室溫下放置2 h。（5）洗膜：用TBST buffer漂洗，漂洗3次、每次10 min。（6）顯色：加入ECL發光試劑，進行數字成像。

1.9 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析和t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清對VIM-1蛋白的影響比較 見表1，圖1。空白組大鼠血清對耐藥蛋白VIM-1的重疊多肽片段產生不同程度的抗體反應，而銅綠假單胞菌感染后，血清抗體反應的明顯變化表明，上表中多肽片段指征的耐藥蛋白VIM-1的抗原決定簇能夠激發大鼠的免疫反應。芪歸銀方組大鼠中，針對表位7-11和36-40的抗體表達強度大于空白和模型組的抗體表達強度（均P＜0.05）；模型組中，針對53-54和56-58表位的抗體反應強度降低（均P＜0.05），而芪歸銀方組的抗體反應雖較正常組為低，但高于模型組大鼠 （P＜0.05）；與空白組比較，模型組和芪歸銀方組大鼠均產生針對23-25表位的較強抗體反應，兩者之間比較差別不大（P＞0.05）；而模型組對80-81表位產生顯著的抗體反應，但在空白組和芪歸銀方組中則無明顯反應（均P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清對VIM-1的抗體表達比較（n）

圖1 各組大鼠血清對VIM-1的抗體表達差異

2.2 各組大鼠血清對SPM-1蛋白的影響比較 見表2，圖2。空白組大鼠血清對耐藥蛋白SPM-1的重疊多肽片段產生不同程度的抗體反應，不相關抗體產生的非特異性反應可能是其中部分原因，針對25-28、61-64和73-76抗原決定簇的抗體反應最有可能是這一原因造成的，但各組間差別不大（均P＞0.05）。感染刺激大鼠產生新的更多地針對13-15和39-40表位的抗體，然而，相較于空白組和芪歸銀方組產生的針對16-19和82-85抗原的免疫反應，模型組大鼠則產生的抗體反應更弱（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清對SPM-1的抗體表達比較（n）

圖2 各組大鼠血清對SPM-1的抗體表達差異

2.3 各組大鼠血清對TEM-1蛋白的影響比較 見表3，圖3。銅綠假單胞菌感染后刺激大鼠免疫系統并且產生更強的針對多肽 19-21、26-27、52-55和66-70的反應，且這些多肽可被認為是特異性的抗原決定簇。各組大鼠血清中抗體針對的陽性表位數目差別不大（均P＞0.05）；芪歸銀方組對TEM-1蛋白19-21和52-55表位的抗體反應強于模型組和空白組 （均P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清對TEM-1的抗體表達比較（n）

圖3 各組大鼠血清對TEM-1的抗體表達差異

3 討 論

多肽陣列技術是一種高通量蛋白質組研究工具，能用多肽模擬蛋白抗原與自身抗體結合，被認為是后基因組時代與基因芯片、蛋白芯片相媲美的新型蛋白位點檢測技術。現已被廣泛應用于藥物篩選、靶標確認、表位定位以及蛋白結構功能和相互作用等研究，應用前景廣闊［13-16］。本實驗首次將多肽陣列技術引入到探索中藥復方對耐藥菌感染作用機制的研究中。檢測結果顯示，與空白和模型相比較，芪歸銀方組大鼠在金屬酶蛋白VIM-1針對7-11和36-40表位的抗體反應明顯增強，這說明中藥治療能夠刺激淋巴細胞產生針對這些表位的抗體。同時，針對表位7-11和36-40的抗體可能通過中和VIM-1耐藥蛋白誘發有益的效應，并對大鼠機體產生保護作用。而對于金屬酶SPM-1而言，在銅綠假單胞菌感染后針對13-15和39-40表位出現更強的抗體反應，表明感染刺激免疫系統產生特異性抗體，但芪歸銀方治療并沒有對上述抗體反應產生可辨別的變化，表明對這些特異性抗體可能沒有產生影響。而對于TEM-1蛋白，芪歸銀方組較模型組大鼠血清針對26-27、52-55和66-70的抗體反應增強，表明芪歸銀方可能通過刺激這些特異性抗體的產生而發揮其對感染后大鼠更佳的保護作用。上述結果與前期相關研究具有較好的一致性，相互印證了芪歸銀方能夠通過調節機體免疫應答反應，糾正耐藥菌感染后導致的免疫紊亂，具提高抗多重耐藥菌感染臨床療效的潛力與優勢，值得進一步深入研究。