穩斑湯對ApoE基因敲除小鼠AS不穩定斑塊凋亡相關基因Caspase-3表達的影響*

于長生 宮麗鴻 肖福龍

（遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032）

動脈粥樣硬化是引起心腦血管病的重要病理基礎，主要表為血管壁出現粥樣物質，導致血管腔不同程度狹窄，最終引起血管堵塞，出現供血障礙。近年來動脈粥樣硬化的發病率及致死率逐年上升［1］。動脈粥樣硬化的發病機制可以從不同角度進行闡述［2］。研究表明動脈粥樣硬化的獨立危險因素之一是凋亡［3］，斑塊內細胞的凋亡不利于斑塊穩定。細胞凋亡參與了動脈粥樣硬化的發病過程。Caspases屬于半胱氨酸蛋白酶， 其對于凋亡有重要的促進作用［4］。 前期研究［5-7］證明搜風祛痰中藥復方穩斑湯具有抗動脈粥樣硬化及穩定斑塊作用，因此本文在前期基礎上從凋亡角度觀察穩斑湯對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩定斑塊凋亡相關基因Caspase-3表達的影響，以便于探討穩斑湯抗動脈粥樣硬化的作用機制，豐富穩斑湯的臨床應用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物6～8周ApoE基因敲除小鼠70只，正常 C57BL/6J小鼠12只，由北京大學實驗動物中心美國Jackson實驗室成功引進并培育，實驗動物合格證號：SCXK （京）2013-0001。SPF級，體質量（19.0±1.0）g，雌雄各半。用含1.5%膽固醇的高脂飼料（經60Coγ滅菌照射處理，遼寧中醫藥大學動物實驗室提供）飼養ApoE基因敲除小鼠，正常小鼠給普通飼料喂養，飼養條件為2級，室溫保持在22～24℃，相對濕度 50%，光照時間 7∶00～19∶00，自由飲食水。

1.2 試藥與儀器 1）試藥。穩斑湯組方：地龍15 g，全蝎 5 g，水蛭 15 g，蜈蚣 1 條，陳皮 15 g，白術 15 g，半夏15 g。將上述中藥加工，并制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液，由遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局生產；阿托伐他汀鈣片10 mg/片（輝瑞制藥有限公司，批準文號J20030047）。蘇木精染液、伊紅染液（北京博奧森生物科技有限公司）；兩步法RT-PCR試劑盒（購自北京全式金生物技術有限公司，批號AT401-D1）；DNA maker（購自北京全式金生物技術有限公司，批號BM121-01）；Trizol（購自 invitrogen 公司，批號 15596-026）；引物（北京三博遠志生物技術有限公司代為合成）。2）儀器：300型脫水機，EG1150型石蠟包埋機，RM2235型切片機均為德國Leica公司產品；BX41型數碼顯微鏡，CHA型光學顯微鏡均為Olympus公司產品。

1.3 模型制備 13周后，隨機處死4只，取腹主動脈根部，HE染色觀察動脈粥樣硬化程度，確定模型制造成功。

1.4 分組與給藥 造模成功的ApoE基因敲除小鼠66只，隨機選取60只分為模型組，穩斑湯低、中、高劑量組及他汀組，每組12只。繼續予高脂飼料喂養，根據成人每日臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體表面積折算系數0.0026折算成小鼠用量。模型組給予生理鹽水0.3 mL/d，穩斑湯低、中、高劑量組分別給予穩斑湯 6.175、12.35、24.7 g/（kg·d），他汀組給予阿托伐他汀 27.3 mg/（kg·d）。 各組每日灌胃給藥 1次。 正常C57BL/6J小鼠12只設為空白對照組，給予普通飼料喂養，生理鹽水0.3 mL/d灌胃。各組均給藥7 d。

1.5 標本采集與檢測 末次給藥當日夜晚禁食，第2天取材。每組分別隨機選取10只小鼠，禁食并經眼眶靜脈叢取血，將血清離心，并凍存于-80℃。脫頸處死小鼠，解剖并取心臟及主動脈，利用10%甲醛固定心臟，凍存管內保存主動脈。1）主動脈組織病理學觀察：于主動脈根部取出4個相同切面，0.9%氯化鈉溶液沖洗，固定，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，6 μm厚度進行切片。繼而進行蘇木精-伊紅染色，樹膠封片。光鏡下觀察其組織形態。2）Caspase-3 mRNA檢測：采用RT-PCR法檢測各組小鼠動脈組織中Caspase-3 mRNA的表達。Trizol抽提法提取動脈組織中總RNA，測定濃度及質量后，采用一步法RT-PCR試劑盒，以β-actin為內參，對Caspase-3相應引物進行擴增（引物序列：上游引物：5′-CTGGACTGCGGTATTG AG-3′， 下游引物：5′-GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3′，102 bp）。PCR 反應體系：cDNA 3 μL，10 mmol/LdNTP 2.5 μL，25 mmol/L Mg2+5 μL，10×PCR Buffer 5μL，DEPC H2O 31 μL，Taq 酶 0.5 μL，Caspase-3、β-action 引物各 1.5 μL。 94℃變性 1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸1.5 min，循環35次。擴增產物與1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像分析系統中采集圖像，并測定目的基因和內參基因擴增條帶的積分光密度值，并以目的基因積分光密度值/內參基因積分光密度值的比值作為該例樣本目的基因的相對表達水平，進行統計分析。

1.6 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件。計量資料以（±s）表示。組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠主動脈形態學改變的比較 見圖1。空白組：小鼠主動脈內膜表面光滑未見異常。模型組：動脈管壁破損，并有明顯的粥樣硬化斑塊出現，斑塊內可見大量泡沫細胞，偶有一些炎性細胞。穩斑湯組、他汀組：主動脈內膜均有不同程度的斑塊，但其面積均小于模型組。

圖1 各組小鼠腹主動脈病理情況（HE染色，100倍）

2.2 各組小鼠主動脈組織中Caspase-3的mRNA表達水平的比較 見表1、圖2。與空白對照組比較，模型組Caspase-3 mRNA含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，穩斑湯中、高劑量組Caspase-3 mRNA含量均降低（P＜0.05）。與他汀組比較，穩斑湯中、高劑量組Caspase-3 mRNA含量無明顯差異（P＞0.05）。

3 討 論

古代中醫并沒有動脈粥樣硬化病名，根據臨床表現可將其歸屬于胸痹心痛等疾病。患者多食膏粱厚味，以致脾傷虛而生痰，痰瘀互結以致內癰毒熱生風。風邪特點為善行而數變，風痰內動，相似于動脈粥樣硬化斑塊的破裂。正如《醫方考》言“風痰者，濕土生痰，痰生熱，熱生風也”，故宮麗鴻教授創新性提出風痰理論并創以穩斑湯治療此病，方藥中蜈蚣具有息風、止痙、通絡功效；全蝎具有息風、通絡、散結功效；地龍具有息風、平喘、通絡功效，3藥合用共為君藥。而白術、陳皮、半夏具有寬胸理氣、燥濕化痰作用，為臣藥；水蛭具有破血逐瘀、通經作用，用為佐藥，上述7味藥物發揮搜風祛痰、祛瘀通絡作用。

表1 各組小鼠主動脈組織中Caspase-3mRNA表達水平（±s）

表1 各組小鼠主動脈組織中Caspase-3mRNA表達水平（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與空白對照組比較，△P＜0.05

組 別 n空白對照組 10模型組 10他汀組 10 Caspase-3 mRNA 0.194±0.023 0.497±0.029△0.266±0.043*穩斑湯低劑量組 10 0.448±0.114△穩斑湯中劑量組 10 0.324±0.042*△穩斑湯高劑量組 10 0.257±0.038*

圖2 各組主動脈組織Caspase-3 mRNA表達電泳圖

動脈粥樣硬化嚴重影響人類健康和生活質量，其危險因素包括高齡、高血糖、同型半胱氨酸、吸煙等。不穩定斑塊的破裂可致嚴重心血管事件發生，威脅患者生存［8］。動脈內膜有不穩定斑塊形成是動脈粥樣硬化的特征性表現。動脈粥樣硬化的病理生理機制多種多樣［9-10］，目前研究認為與脂質損傷、炎癥損害、氧化損傷、免疫功能障礙等因素相關。

細胞凋亡屬于細胞程序性死亡［11］，并且是細胞主動死亡。細胞凋亡的特征主要是細胞膨脹繼而出現皺縮，染色質凝聚成新月狀，細胞膜內陷，進而導致細胞破裂，凋亡小體形成，被巨噬細胞消化［12］。很多刺激均可誘導細胞發生凋亡。細胞受到刺激作用，產生正向的細胞信號，通過線粒體啟動細胞凋亡［13］。心血管疾病的發病過程中由細胞凋亡的參與，如動脈粥樣硬化。因此，減少細胞凋亡的發生對于治療和預防AS具有至關重要作用。細胞凋亡的誘導通路主要包括死亡受體通路和細胞應激途徑，Caspase-3的激活與他們密切相關［14］，因此Caspase-3被認為是細胞凋亡的關鍵酶，線粒體在此中具有關鍵作用［15］。研究表明線粒體的損傷與心血管疾病的發生密切相關［16］。線粒體受到損傷后釋放CytC到胞質，激活Caspase-3，進而被分為兩部分從而誘導凋亡［17］。有研究發現上調Bcl-2的表達，調節Caspase活性，減少CytC的釋放，從而抑制oxLDL導致的巨噬細胞凋亡［18］。吳限等［19］研究結果表明心腦通絡液能降低Caspase-3的表達，上調Bcl-2的表達，從而延緩動脈粥樣硬化的進展起到抗動脈粥樣硬化的作用。 徐欣華等［20］研究表明 Caspase-3、MMP2 表達水平與斑塊的不穩定具有相關性。

阿托伐他汀鈣片屬于他汀類藥物，是人工合成的3-羥基-3-甲基-輔酶A還原酶的競爭性抑制劑［21］，具有穩定斑塊，改善血管內皮功能、抗炎、抗氧化應激作用以及抑制血栓的形成等作用，因此阿托伐他汀鈣片是臨床常用的調節血脂，穩定動脈硬化斑塊，預防動脈粥樣硬化的首選藥物［22］。故本實驗選擇阿托伐他汀鈣片作為西藥對照藥。

本研究采用高脂飼料飼養ApoE基因敲除小鼠成功建立動脈粥樣硬化模型，其主要表現為形態學改變，管腔內可見顯著的粥樣硬化斑塊出現，斑塊內可有大量泡沫細胞形成等。與模型組比較，穩斑湯各劑量組的小鼠相關血管病變程度輕、管腔面積增加，說明具有搜風祛痰功能的穩斑湯具有抗動脈粥樣硬化形成的作用。

本研究顯示，與空白對照組比較，模型組Caspase-3 mRNA表達水平升高，表明動脈粥樣硬化發生時，可引起Caspase-3 mRNA表達水平的升高，而穩斑湯中、高劑量組與他汀組均能不同程度地降低Caspase-3 mRNA表達水平，這說明抑制凋亡相關基因Caspase-3表達，可以有效抑制動脈粥樣硬化，穩定動脈粥樣硬化不穩定斑塊。與他汀組比較，穩斑湯中、高劑量組的Caspase-3 mRNA表達無明顯差異，說明穩斑湯中、高劑量組同阿托伐他汀片在抑制凋亡方面作用相當。綜上所述，穩斑湯可能通過下調ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩定斑塊凋亡相關基因Caspase-3的表達來干預動脈粥樣硬化不穩定斑塊的形成及破裂。