基于Nrf-2/OH-1/NF-κB通路探討葡萄籽原花青素對(duì)大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用*

余維微 曾耀明 鄭偉偉 陳余圣

（浙江省溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

目前，肝性疾病呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。長(zhǎng)期大量飲酒易引發(fā)酒精性肝炎。酒精性肝病嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生，人們?cè)絹?lái)越重視對(duì)肝臟的保護(hù)。葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提取的生物類(lèi)黃酮物質(zhì)，溶解性好且易于吸收。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素具有較強(qiáng)抗氧化性，能夠緩解肝功能障礙，提高機(jī)體免疫等功能［1-3］。已有研究報(bào)道葡萄籽原花青素能減輕CCl4和酒精引起的小鼠肝損傷［4］，但有關(guān)葡萄籽原花青素改善酒精性肝損傷的作用機(jī)制研究還較少。本研究通過(guò)建立酒精性肝損傷大鼠模型，研究葡萄籽原花青素對(duì)酒精性大鼠肝損傷的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠72只，清潔級(jí)，體質(zhì)量160～230 g，購(gòu)自南京君科生物工程有限公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2016-0016。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器 葡萄籽原花青素購(gòu)自西安天豐生物科技有限公司。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Pr）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。核因子E2相關(guān)因子（Nrf2）、血紅素加氧酶（OH-1）、催化亞基（GCLC）抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology （Danvers，USA） 公司， 稀釋度1∶100。 核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（NF-κB p65）和 Iκ-Bα 抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，稀釋度1∶100。RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑（PMSF）、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、電泳上樣緩沖液、PVDF膜、ECL顯色液等Western blotting相關(guān)試劑均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。AU5800全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司。

1.3 分組及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及葡萄籽原花青素低、中、高劑量組。除空白對(duì)照組外其他各組大鼠按劑量10 mL/kg灌胃紅星二鍋頭（56%乙醇），連續(xù)灌胃10周，空白對(duì)照組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液。大鼠造模的同時(shí)給藥治療，陽(yáng)性對(duì)照組按200 mg/（kg·d）劑量灌胃聯(lián)苯雙酯；葡萄籽原花青素低、中、高劑量組按100、200、400 mg/（kg·d）劑量灌胃葡萄籽原花青素；空白對(duì)照組和模型組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液。給藥劑量參考文獻(xiàn)［5］和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。各組均常規(guī)飲水和喂食。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）末次給藥后禁食不禁水12 h后，眼眶取血，離心（3 000 r/min，15 min）。 取上清液，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）含量。2）大鼠處死后迅速解剖取出肝臟，10%中性甲醛固定，制備石蠟包塊，切片，HE染色，顯微鏡下觀(guān)察肝臟病理改變。3）取大鼠肝臟組織，用預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液制成10%肝組織勻漿，采用ELISA法分別根據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)肝組織中MDA、GSH、SOD、GSH-Pr以及 TNF-α、IL-1β 和 NF-κB 水平。 4）取大鼠肝臟組織，加入裂解液在冰上充分裂解30 min，離心（4 ℃，12 000×g，15 min）。 取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品加上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后凝膠蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。TBST清洗后，加入一抗，4℃過(guò)夜。TBST清洗后加入二抗，室溫下放置2 h。TBST清洗后ECL顯色，于凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影。掃描拍照，用Image pro plus 7.0軟件分析蛋白雜交條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，以各蛋白與內(nèi)參灰度值的比值表示其在肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用n表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)觀(guān)察 見(jiàn)圖1。空白對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以中央靜脈為中心周?chē)渭?xì)胞索呈放射狀排列。模型組大鼠肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞索消失。與模型組相比，葡萄籽原花青素各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝臟組織壞死不同程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)觀(guān)察（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠血清ALT和GOT水平比較 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組相比，模型組ALT和GOT水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，葡萄籽原花青素低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組ALT和GOT水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清ALT和GOT水平比較（U/L，±s）

表1 各組大鼠血清ALT和GOT水平比較（U/L，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05。下同

組 別 n ALT GOT空白對(duì)照組 12 36.81±5.46 109.54±8.19模型組 12 183.56±12.27△ 217.61±15.23△陽(yáng)性對(duì)照組 12 45.91±6.18* 116.39±8.97*葡萄籽原花青素低劑量組 12 143.82±11.46* 189.15±11.82*葡萄籽原花青素中劑量組 12 96.38±9.52* 169.73±12.51*葡萄籽原花青素高劑量組 12 59.86±7.24* 128.53±9.43*

2.3 各組大鼠肝組織中 MDA、GSH含量與 SOD、GSH-Pr活力比較 見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組相比，模型組MDA含量顯著升高 （P＜0.05），GSH含量與SOD、GSH-Pr活力顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，葡萄籽原花青素低劑量組SOD活力顯著升高（P＜0.05），葡萄籽原花青素中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組MDA含量顯著降低（P＜0.05），GSH 含量與、GSH-Pr活力顯著升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肝組織中MDA、GSH含量與SOD、GSH-Pr活力比較（±s）

表2 各組大鼠肝組織中MDA、GSH含量與SOD、GSH-Pr活力比較（±s）

組 別 n空白對(duì)照組 12模型組 12陽(yáng)性對(duì)照組 12葡萄籽原花青素低劑量組 12葡萄籽原花青素中劑量組 12葡萄籽原花青素高劑量組 12 MDA（nmol/mg）GSH（nmol/mg） SOD（U/mg） GSH-Pr（U/mg）0.68±0.11 22.61±2.83 795.43±35.16 125.49±15.34 1.59±0.21△ 9.31±1.14△ 235.19±14.29△ 61.28±8.43△0.73±0.14* 17.26±2.51*692.43±30.47*112.85±12.49*1.42±0.20 10.23±1.21 300.49±15.84* 68.01±8.93*1.05±0.17* 14.32±1.95*481.52±22.17* 87.36±10.52*0.76±0.15* 17.32±2.46*658.27±28.43*107.32±12.11*

2.4 各組大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較 見(jiàn)表3。與空白對(duì)照組比較，模型組TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，葡萄籽原花青素中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著降低（P＜0.05）；葡萄籽原花青素低劑量組 TNF-α、IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和NF-κB水平比較（pg/mg，±s）

表3 各組大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和NF-κB水平比較（pg/mg，±s）

組 別 n空白對(duì)照組 12模型組 12陽(yáng)性對(duì)照組 12葡萄籽原花青素低劑量組 12葡萄籽原花青素中劑量組 12葡萄籽原花青素高劑量組 12 TNF-α IL-1β IL-6 33.92±3.57 21.18±3.86 45.61±5.92 157.39±15.47△ 124.25±13.48△ 138.57±13.72△42.82±3.91* 28.43±4.11* 57.33±6.15*115.48±11.53*102.95±11.37*127.83±11.87 80.47±6.92* 60.46±7.43* 85.41±9.57*48.61±4.38* 33.51±4.67* 56.27±5.98*

2.5 各組大鼠Nrf2/OH-1通路和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)圖2、表4。與空白對(duì)照組比較，模型組 Nrf2和 OH-1、GCLC蛋白表達(dá)顯著減少，NF-κB p65和 pIκ-Bα 顯增加（P＜0.05）。 與模型組比較，葡萄籽原花青素中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組Nrf2、OH-1和GCLC蛋白表達(dá)顯著增加，磷酸化NF-κB p65和Iκ-Bα顯著減少（P＜0.05），葡萄籽原花青素低劑量組磷酸化Nrf-2蛋白顯著增加（P＜0.05）。

圖2 Nrf2/OH-1通路和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表4 各組大鼠Nrf2/OH-1通路和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)灰度值比較（±s）

表4 各組大鼠Nrf2/OH-1通路和NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)灰度值比較（±s）

組 別 n空白對(duì)照組 12模型組 12陽(yáng)性對(duì)照組 12葡萄籽原花青素低劑量組 12葡萄籽原花青素中劑量組 12葡萄籽原花青素高劑量組 12 Nrf-2 OH-1 GCLC 1.26±0.11 0.98±0.08 0.31±0.05 0.44±0.04△ 0.35±0.03△ 0.23±0.02△1.09±0.10*0.93±0.09*0.28±0.03*0.54±0.04*0.36±0.04 0.21±0.03 0.87±0.06*0.45±0.04*0.26±0.02*0.98±0.10*0.92±0.08*0.31±0.06*NF-κB p65 pIκ-Bα 0.34±0.05 0.35±0.07 0.95±0.07△ 0.94±0.08△0.43±0.04*0.44±0.05*0.91±0.06 0.89±0.07 0.82±0.08*0.79±0.09*0.67±0.06*0.64±0.05*

3 討 論

酒精性肝病在我國(guó)的發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，可通過(guò)保肝護(hù)肝食品或者保健品來(lái)滋養(yǎng)防范。葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提煉出來(lái)的具有抗氧化等活性的物質(zhì)，而葡萄籽是生產(chǎn)葡萄汁和葡萄酒的廢棄部分，因此，對(duì)于開(kāi)發(fā)保肝護(hù)肝藥物具有良好的發(fā)展前景。

機(jī)體在大量攝入乙醇后，經(jīng)乙醇脫氫酶催化脫氫被氧化，三羧酸循環(huán)發(fā)生障礙以及脂肪酸氧化減弱從而影響脂肪代謝，乙醇還能激活氧分子產(chǎn)生氧自由基引起肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽耗竭。ALT和GOT是反映肝功能的重要生化指標(biāo)，肝臟組織受到損傷時(shí)，組織和血清中ALT和GOT水平會(huì)升高［6］。本實(shí)驗(yàn)連續(xù)兩周給大鼠灌胃紅星二鍋頭后，模型組大鼠肝細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞索消失，ALT和GOT含量升高，說(shuō)明大鼠灌胃乙醇后肝組織損傷，肝功能降低，酒精性肝損傷大鼠模型建立成功。MDA是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，其含量變化間接反映氧自由基含量的變化，在一定程度上反映細(xì)胞損傷程度［7］。SOD和GSH均是體內(nèi)重要的自由基清除劑，GSH-Pr是重要的抗氧化酶，可介導(dǎo)GSH清除H2O2和脂質(zhì)過(guò)氧化物［8］。本研究結(jié)果顯示，葡萄籽原花青素作用后，與模型組相比，不同濃度的葡萄籽原花青素可降低大鼠肝臟組織MDA含量，提高GSH水平與SOD、GSH-Pr活力，說(shuō)明葡萄籽原花青素能改善大鼠酒精性肝損傷，表現(xiàn)出肝保護(hù)作用，原因可能是葡萄籽原花青素具有較強(qiáng)抗氧化活性和清除自由基的作用。

Nrf2是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)氧化還原平衡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，自由基或親核物質(zhì)刺激時(shí)發(fā)生磷酸化，Nrf2和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白發(fā)生解離，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)Nrf2下游靶基因血紅素氧合酶1（OH-1）、GCLC等抗氧化酶的表達(dá)而發(fā)揮抗氧化功能［9-10］。研究表明，大量酒精作用能抑制Nrf2的正常活化表達(dá)，導(dǎo)致酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激加重［11］。本研究結(jié)果顯示，葡萄籽原花青素能提高酒精性肝損傷大鼠Nrf2和OH-1蛋白表達(dá)，其可能通過(guò)上調(diào)Nrf2/OH-1信號(hào)通路，激活了下游抗氧化酶的表達(dá)，從而減輕了酒精對(duì)大鼠肝臟造成的損傷。酒精引起的氧化損傷還可以繼發(fā)性激活肝臟炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)［12］。NF-κB是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞被激活后，NF-κB p65 與抑制因子 Iκ-Bα 快速磷酸化為 pIκ-Bα，復(fù)合物被水解，胞漿內(nèi)的NF-κB p65移位進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮基因調(diào)控作用，促進(jìn)下游TNF-α、IL-1β和IL-6等大量炎性細(xì)胞因子分泌，在炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［13-15］。本研究結(jié)果顯示，葡萄籽原花青素高劑量組NF-κB p65和pIκ-Bα較模型組顯著減少，說(shuō)明葡萄籽原花青素可抑制Iκ-Bα磷酸化，也可能通過(guò)NF-κB通路保護(hù)肝組織損傷。其下游炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平變化與NF-κB p65和pIκ-Bα蛋白變化一致，進(jìn)一步說(shuō)明葡萄籽原花青素可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的激活從而保護(hù)肝組織損傷。

綜上所述，葡萄籽原花青素可能激活Nrf2/OH-1信號(hào)通路，促進(jìn)下游抗氧化酶的表達(dá)，同時(shí)抑制了酒精性肝損傷大鼠NF-κB信號(hào)通路的激活，從而減輕了酒精引起的肝損傷大鼠的損傷。