補肝益腎通絡法對佐劑型關節炎大鼠Th17/Treg平衡的影響*

郭德強 張春芳 周亞濱 張萬里 趙麗華 馬曉雪

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱 150040）

類風濕關節炎（RA）為難以治愈的自身免疫疾病，臨床以滑膜炎、血管翳為基本病理表現，具有對稱性和致殘率高的特性，其臨床表現主要為累及關節滑膜的炎癥、晨起僵硬、日久導致軟骨及骨組織的侵蝕和關節結構的破壞等［1-2］，如不及早治療，日久后會引起關節變形，以致工作能力的喪失。自擬湯是基于先前研究［3-5］，在三痹湯的基礎上化裁而來，本實驗以佐劑型關節炎大鼠為實驗對象，觀察補肝益腎通絡法對Th17/Treg平衡的影響。

在RA的現在研究中對于其發病機制尚未明確，但免疫紊亂仍然其發病的主要原因，一般都認為和T細胞有關，最近研究表明［6］，Th17細胞在RA發生發展過程中起著主要作用，而Treg細胞在抑制炎癥反應的地位尤為突出。Th17細胞通過產生促炎性細胞因子白細胞介素-17（IL-17）促進骨滑膜炎性的產生，以致骨和關節的損傷［7-8］，Treg細胞通過發揮抑制炎性反應作用，降低炎性因子的產生而發揮其免疫應答過程［9］。根據近年來研究報道RA患者的各種病因導致Th17細胞增多，同時造成與之對抗的Treg細胞減少，以至于造成Th17/Treg平衡失調，最終會導致其發生炎性反應、關節遭受破壞和骨侵蝕［10］。因此Th17/Treg平衡在RA發生發展過程中起著重要作用，因此糾正Th17/Treg平衡有著重要意義。本研究圍繞著補肝益腎通絡法對佐劑型關節炎模型大鼠脾臟中的Th17/Treg平衡的影響進行觀察，為臨床治療RA提供可靠的實驗依據。現報告如下

1 材料與方法

1.1 實驗動物 于黑龍江中醫藥大學的實驗動物基地采購雌性Wistar大鼠40只，選擇5～7周齡，體質量（180±10） g，大鼠許可證號：SCXK（黑）2013-001。 大鼠喂養于獨立的動物實驗室內。保持通風恒溫恒濕環境，喂養中善待動物，符合動物的倫理要求。

1.2 試藥與儀器 在前期研究基礎上選用三痹湯加減（杜仲、川續斷、人參、白芍、白茯苓、當歸、甘草、杜仲、防風、肉桂、黃芪、牛膝各30 g，獨活、川芎、雞血藤各15 g）。15味中藥均購于哈爾濱市藥材公司，所有的中藥材用3倍劑量的水浸泡1 h后，煎2次，第1次煎3 h，第2次煎2 h。兩次煎藥液混合后煎煮濃縮。雷公藤湯液的制備：將雷公藤中藥切碎，用3倍劑量的水浸泡1 h后，煎煮方法同上，濃縮為大鼠1 d的劑量。弗式完全佐劑（FCA，美國 Sigma公司，批號 1001655385），離子霉素、佛波醇乙酯、蛋白質轉運抑制劑莫能菌素（美國Sigma公司），EDTA脫鈣液 （美國Biotpped公司）。足容量測量儀（自制），用于觀察滑膜組織的光學顯微鏡購自日本的Olympus公司，批準文號CX23。測定Th17、Treg細胞的流式細胞儀器購自美國Bio-rad公司，批準文號 20142400183，-80 ℃冰箱（905-ults，賽墨飛世爾科技有限公司），CO2的細胞培養箱 （美國New Brunswick公司，型號 Galaxy170R）。

1.3 分組與造模 采購的大鼠選擇標準的隨機數字表法來分為空白組、模型對照組、自擬湯組、雷公藤組，每組取10只，實驗過程中，分籠飼養，每個籠子里5只大鼠，自然光照，并定期清潔、消毒。除空白組大鼠外余組制作模型，從冰箱取出FCA，充分搖勻后，將所有大鼠進行消毒，消毒后將大鼠后肢拉直，選用1 mL注射器、對準右后足跖的中部，皮下注射0.1 mL FCA。3組均制備佐劑型關節炎大鼠模型，模型成功建立的標準按照關節炎評分指數標準，3組大鼠造模成功。

1.4 給藥方法 按照人和大鼠給藥劑量的體表面積換算公式計算出用藥劑量，于造模后的第9天開始灌胃給藥，自擬湯中給予質量濃度1.85 g/mL，2 mL/d灌胃。與此同時，空白組、模型對照組給予同等劑量的0.9%氯化鈉注射液喂服，連續喂服3周。

1.5 標本采集與檢測 1） 分別于0、1、2、3、4周時使用自制的足容積測量儀來測量每個組的大鼠足容積，以每組大鼠的足容積變化來作為足腫脹度觀察指標。2）造模后21 d后處死每組大鼠，用刀片從雙膝關節剝離出完整的滑膜組織，用4%的多聚甲醛將其固定2 h，用10%的EDTA脫鈣1周，梯度酒精脫水，HE常規染色，于光學顯微鏡下來觀察處理后的關節滑膜的病理變化。3）流式細胞分析檢測Th17、Treg細胞的表達：取大鼠脾臟淋巴細胞，調整細胞濃度為1×106個/mL，接種24孔板，與離子霉素、佛波醇乙酯、蛋白質轉運抑制劑莫能菌素混合于恒溫的5%CO2的細胞培養箱中培養 4 h，收集細胞，重懸與 100 μL的 PBS，收集細胞，洗液洗2次，加入IgG抗體，封閉FcR，進行表面標志染色，之后加入熒光標記的IL17抗體，選用流式細胞儀進行檢測分析，對于Treg細胞的檢測，直接進行胞內染色進行，方法同上。Th17細胞和Treg細胞的測定由黑龍江中醫藥大學分子實驗室協助完成。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，選用單因素方差分析來進行多組間比較，多組間兩兩比較選用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 自擬湯對大鼠足量的影響 見表1。與空白組比較，造模后的模型組、自擬方劑量組大鼠足容積于第1周、第2周、第 3周、第 4周明顯增大（P＜0.05），提示AA大鼠模型制備成功。與模型對照組比較，自擬湯組和雷公藤組的大鼠足容積于第2、3周明顯減小 （P＜0.05）。

2.2 自擬湯對AA大鼠病變關節及關節周圍軟組織的影響 見圖1。關節和滑膜的病理變化：空白組大鼠剝離的關節滑膜組織細胞排列規則，表面光滑且無炎性細胞浸潤，無關節軟骨、骨結構的破壞。模型對照組大鼠通過光鏡來觀察其滑膜組織，觀察到滑膜增生，伴有充血、水腫，細胞排列無序，滑膜襯底細胞間隙增大，伴有小血管增生，大量纖維沉積，關節表面粗糙。自擬湯組增生程度減輕，炎性反應減弱，散在的炎性細胞如中性粒細胞、單核細胞的浸潤，光鏡下可見少量的小血管增生。雷公藤組于光鏡下見輕度的滑膜增生伴有散在的浸潤的炎性細胞，未見明顯增生，光鏡下見少量的小血管增生。

表1 自擬湯對大鼠足容積的影響（mL，±s）

表1 自擬湯對大鼠足容積的影響（mL，±s）

與空白組同時間比較，△P＜0.05；與模型組同時間比較，*P＜0.05；與自擬湯組同時間比較，#P＜0.05。

第3周 第4周1.62±0.017 1.68±0.011 1.61±0.015 1.69±0.015 2.81±0.013△ 2.80±0.014△（n＝10） 左 1.49±0.015 1.63±0.013△ 2.11±0.011△ 2.19±0.014△ 2.25±0.012△自擬湯組 右 1.51±0.012 1.73±0.015△ 2.43±0.015△*2.38±0.011△*2.01±0.011△*（n＝10） 左 1.49±0.011 1.62±0.012△ 2.12±0.013△*2.04±0.014△*1.98±0.017△*雷公藤組 右 1.51±0.011 1.74±0.011△ 2.43±0.017△*2.36±0.014△*#2.03±0.014△*#（n＝10） 左 1.49±0.016 1.62±0.014△ 2.10±0.015△*2.05±0.012△*1.97±0.012△*組 別空白組 右（n＝10） 左模型組 右第0周 第1周 第2周1.51±0.014 1.53±0.014 1.56±0.013 1.49±0.013 1.53±0.015 1.55±0.012 1.50±0.014 1.74±0.012△ 2.41±0.016△

2.3 自擬湯對大鼠Th17和Treg細胞的影響 見表2。其余3組與空白組比較，Th17細胞數量比率明顯升高，Treg細胞的數量比率明顯降低（均P＜0.05），與模型組比較，自擬湯組和雷公藤組Th17細胞的數量比率明顯降低 （P＜0.05），Treg細胞的比率有所上升 （P＞0.05）；自擬湯組與雷公藤組比較，Th17細胞數量變化與Treg細胞相比其比率無統計學意義（P＞0.05）。

表2 自擬湯對大鼠Th17和Treg細胞的影響（%，±s）

表2 自擬湯對大鼠Th17和Treg細胞的影響（%，±s）

組 別 n Th17細胞 Treg細胞空白組 10 1.21±0.55△ 11.09±1.15模型組 10 2.34±0.23△ 8.25±0.67△自擬湯組 10 1.67±0.33*△ 10.21±0.37△雷公藤組 10 1.62±0.61*△ 10.52±0.21△

3 討 論

RA在發生發展過程中因免疫細胞活化的參與以及數種細胞因子而呈進行性發展。研究發現，Th17細胞通過產生促炎性細胞因子白細胞介素-17促進骨滑膜炎性的產生，以致骨和關節的損傷［11］，而Treg細胞通過產生一些白細胞介素-10和轉化生長因子-β等抑制性細胞因子來調節RA中免疫應答過程［12］。Th17細胞和Treg細胞分化過程既有共同之處又相互對抗，影響著RA的發生和轉歸。近幾年研究表明，雷公藤在調節Th17/Treg平衡有著突出的效果［13-14］。在先前研究的基礎上，發現運用補肝腎，益氣血，通經絡的方法，能減輕關節滑膜的炎細胞浸潤，但對Th17/Treg的影響尚不清楚。本研究運用補肝腎、益氣血、通經絡的方法對造模大鼠的治療，通過用流式細胞術對Th17和Treg細胞數量的觀察，發現補肝腎、益氣血、通經絡的方法對Th17/Treg的平衡具有調節作用。

本研究采用AA大鼠模型，觀察運用補肝腎、益氣血、通經絡的方法對大鼠體內Th17和Treg細胞的影響。根據研究結果表明，與空白組對比，其余3組在造模后均有炎癥反應，自擬湯組和雷公藤組與模型組比較，造模大鼠經自擬湯組與雷公藤組治療后，關節滑膜炎性浸潤受到抑制，延緩關節軟骨與周圍組織的破壞。AA大鼠模型的比率明顯升高，Treg細胞的比率明顯降低，自擬湯組和雷公藤組對于降低Th17細胞比率具有明顯作用，在一定程度上促進了Treg細胞的表達。

RA屬于中醫學“痹證”的范疇，其有多種別稱，亦有將其稱為歷節、白虎歷節等病名者。明·龔廷賢《壽世保元》云“疼痛不仁，兩尺脈來沉細者，此痹癥也。內經曰，寒氣勝者為痛痹……今疼痛不仁，是寒而且著也”。本病乃由機體痹著風寒濕邪日久，以致肝腎不足，經絡痹阻，氣血虧虛所致。如《證治匯補·痹癥》云“由元精內虛，而三氣所襲……流注經絡，久而成痹”［15］。自擬方由三痹湯加減而成，在先前研究中［16-17］，三痹湯在調控致炎因子水平具有良好的效果。三痹湯源于《婦人良方》卷三，具有補氣血、益肝腎、通經絡的作用，方中選用四君子湯和四物湯共奏補氣血之功效，方中杜仲、續斷、牛膝有補益肝腎作用，當歸、川芎、秦艽、獨活活血以通經絡。實驗研究表明，補肝益腎通絡法能降低Th17的含量，調和關節炎性反應，具有突出的臨床意義。