siRNA干擾TWSG1表達對SGC-7901細胞增殖的影響*

吳佳艷,袁靜怡,曾嘉麗,劉 玥,3△

(1.南方醫科大學基礎醫學院，廣州 510515；2.南京醫科大學基礎醫學院，南京 210000；3.廣東省單細胞技術與應用重點實驗室，廣州 510515)

日前，扭轉原腸胚形成同系物1(twisted gastrulation protein homolog1，TWSG1)與骨骼、腎臟、膽管等相關癌癥密切相關[4-5]。現有研究表明，TWSG1基因直接影響到骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)以及相關信號通路。TWSG1基因沉默對生物(斑馬魚)的發育有顯著影響，TWSG1基因的激活或者沉默在不同器官中可能有不同的效應[4]。但目前對TWSG1在胃癌中的研究甚少。RNA干擾(RNA interference，RNAi)指由RNA誘發基因沉默[6]。RNA干擾技術因其高特異性、高效性、長效性，在腫瘤的臨床治療中的應用越來越多[7]。本研究使用siRNA干擾人胃癌細胞SGC-7901中的TWSG1基因，觀察其對SGC-7901細胞株增殖與凋亡的影響，為探尋新的有效治療胃癌的方法提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 人胃癌細胞株SGC-7901由南方醫院中心實驗室提供，于DMEM完全培養基中培養(內含10%的胎牛血清，100 μg/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素)。所有細胞均置于37 ℃，含5%二氧化碳的培養箱中培養，換液情況視細胞貼壁生長情況而定，待細胞達到合適的密度，用胰酶消化傳代。

1.1.2儀器 離心機(美國Beckman公司)； Infinite M200酶標儀(瑞士Tecan公司)；Nano Drop2000超微量分光光度計(Thermo公司)；小型水平電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Mini-Protean Tetra電泳系統(美國Bio-Rad公司)；Eclipse Ti-s熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；7500Real-Time PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；Biorad MJ Mini 梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)；HF90二氧化碳培養箱(中國力康生物醫療科技控股有限公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.1.3藥品與試劑 SGC-7901細胞(南方醫院中心實驗室提供)，pLVX-shRNA1質粒(本室保存)，DEME培養基、胎牛血清、PBS、胰蛋白酶、鏈霉素和青霉素(美國Gibico公司)，嘌呤霉素(美國Sigma公司)，Lipofectamine 2000、Trizol(Invitrogen公司)，Prime Script RT reagent Kit 、SYBR Premix Ex Taq TMⅡKit(Takara公司)，RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)，PVDF膜(Millipore公司)，TWSG1兔抗人多克隆抗體(Abcam公司)，HRP標記的羊抗兔IgG(北京天德悅公司)，ECL發光液(美國Thermo Scientific Pierce公司)，CCK8(日本Dojindo公司)，Annexin V-FITC和PI(江蘇凱基生物技術股份有限公司)，引物和siRNA(上海生工生物股份有限公司合成)。

1.2方法

1.2.1siRNA干擾TWSG1表達后篩選穩定表達的細胞株 使用siDirect針對TWSG1基因設計siRNA并合成，與載體連接。實驗組分為3組：空白對照組(SGC-7901細胞)、陰性對照組(轉染空載體,7901-vector)、siRNA干擾組(轉染連接siRNA的載體,7901-siRNA1、7901-siRNA2、7901-siRNA3)。轉染篩選后采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western blot分別鑒定mRNA和蛋白，鑒定干擾效果顯著后進行后續實驗。

1.2.2RT-PCR檢測TWSG1 mRNA表達 采用Trizol提取收集的各組細胞RNA。采用Prime Script RT reagent Kit制備cDNA，采用RT-PCR以GAPDH為內參檢測TWSG1 mRNA的表達水平。

1.2.3Western blot檢測TWSG1蛋白表達 取對數生長期的細胞用胰酶消化后，RIPA裂解液提取蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。用10%丙烯酰胺凝膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。低溫下用濕轉法轉膜，免疫印跡后進行曝光，利用凝膠成像系統采集并分析圖像。

比如，有些詞語，從表面解釋較為理性，這時，教師應引導學生用感性的方式去突破這種客觀限制，正所謂“條條大路通羅馬”。如人教版第十冊《我的伯父魯迅先生》中，在救助車夫這個片段中，有個詞——“飽經風霜”，如果只是照搬詞典的意思，顯然理解起來是蒼白的。如果能讓學生走進生活去理解這個詞，說說生活中，你看過的飽經風霜的臉，顯然這樣更能幫助學生走進文本，去感受車夫遭受的困境。通過這種的學習方式，“飽經風霜”這個詞在情感上體會得更加深刻，深入到學生們的精神世界中。

1.2.4CCK8檢測細胞增殖 在96孔板按照1 000個細胞/孔接種SGC-7901細胞，分為空白對照組、陰性對照組和siRNA干擾組各3孔。分別于培養箱培養24、48 h以及72 h時，加入CCK8檢測試劑。培養箱繼續培養4 h，測定450 nm吸光度(OD值)值。繪制細胞增殖曲線。

1.2.5AnnexinV-FITC/PI染色法進行細胞周期檢測 PBS洗滌轉移下的細胞，用染色結合液制成單細胞懸液，再加入染色液，輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育，最后用流式細胞儀進行檢測。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，實驗結果采用ANOVA進行分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1siRNA干擾TWSG1 mRNA表達效率 siRNA干擾TWSG1 mRNA表達高(P<0.05)，RT-PCR檢測mRNA表達結果見圖1。

圖1 干擾后各組細胞中TWSG1mRNA的表達

表1 干擾后各組細胞中TWSG1蛋白的相對灰度值

*：P<0.05 ，與空白對照組比較;#：P<0.05 ，與陰性對照組比較

2.2siRNA干擾組TWSG1的蛋白表達低 各組細胞Western blot檢測結果顯示(圖2，表1)，siRNA干擾組中TWSG1蛋白表達受到抑制(P<0.05)，7901-siRNA1尤其顯著。結合PCR結果，可認為成功構建了siRNA干擾TWSG1表達模型。

1:空白對照組；2:陰性對照組；3:7901-siRNA1組；4:7901-siRNA2組；5:7901-siRNA3組

圖2干擾后各組細胞中TWSG1蛋白的表達

2.3siRNA干擾TWSG1基因表達促進SGC-7901細胞增殖 用CCK8檢測各組增殖情況，以24 h為基礎，在48、72 h時，siRNA干擾組SGC-7901細胞分別增殖339%、850%； 而空白對照組僅增殖173%、644%。SiRNA干擾組SGC-7901細胞的增殖與其他兩組比較顯著增加(P<0.05)，見圖3。

2.4siRNA干擾組后細胞周期的變化 siRNA干擾TWSG1基因表達促進SGC-7901細胞增殖，更高比例的細胞從G1期進入S期,見圖4。

圖3 干擾后各組細胞的生長曲線

*：P<0.05，與空白對照組、陰性對照組比較

圖4 siRNA干擾后細胞在不同時期的百分比

3 討 論

研究表明TWSG1基因編碼保守疏水蛋白，調控BMP信號通路[4-5]。目前大部分研究是通過BMP通路探討TWSG1表達與鐵調素表達的關系；也有研究表明TWSG1基因沉默將導致生物發生障礙或缺陷，小鼠與斑馬魚等試驗均證實這一觀點[4-5]，可見TWSG1是一個關鍵基因。現有文獻提示TWSG1對不同器官的腫瘤具有雙向性調控：在結腸癌中可能是抑癌基因[8-9]；在乳腺癌中有促進腫瘤發生的功能[10]。臨床發現家族性結腸癌患者均有TWSG1缺失或表達低下[9]，細胞學實驗也顯示TWSG1對結腸癌有抑制作用。推測TWSG1在結腸癌中是抑癌作用，在信號通路中，TWSG1是一種富含亮氨酸的分泌蛋白，與BMP結合蛋白作用，通過USP53途徑抑制細胞增殖。以TWSG1促進乳腺癌發生為例，TWSG1是BMP的結合蛋白，調節細胞外的BMP2、BMP4、BMP7等配體[11]。青春期時在肌上皮和終末芽體細胞中均可表達TWSG1，在導管成熟后，主要表達限于肌上皮層。TWSG1的全缺失導致導管伸長延遲，二級分支減少，末端芽增大，這與腔上皮細胞數量的增加和細胞凋亡的減少有關。在胚胎乳腺發育中，當BMP靶基因的表達降低、BMP信號傳導降低的同時，pSMAD1、5、8水平也對應降低。管腔特異性的GATA-3在TWSG1-/-胚胎乳腺中減少。TWSG1對BMP信號傳導的調節使正常導管伸長，導管進行分支，管腔形成和出生后胚胎乳腺中的肌上皮區室化。總之，TWSG1啟動子區域中CpG島的異常甲基化可能在暴露于不利條件時會促進腫瘤細胞活力或分化，最終導致腫瘤。為何一個基因，在不同組織里卻有截然不同的作用呢？這還要從TWSG1與BMP之間的關系入手。TWSG1與BMP結合蛋白相互作用，TWSG1可以作為BMP拮抗劑[12]和激動劑[13]。BMP對癌癥有一定的抑制作用[14-15]，由于TWSG1對BMP的不同作用，導致了TWSG1在不同組織里有促進或抑制癌癥的功能。本研究結果提示TWSG1極可能是BMP激動劑，siRNA干擾TWSG1后其表達下調，與BMP作用弱化，使SGC-7901細胞株增殖。

本研究重點研究了TWSG1表達異常對SGC-7901增殖的影響。在培養48、72 h時，在siRNA誘導低表達TWSG1調控下的SGC-7901的增殖速度是空白對照組的1.96、1.32倍。實驗數據表明，siRNA干擾使TWSG1表達下調，低表達的TWSG1促進SGC-7901的增殖。TWSG1對SGC-7901的增殖能力有顯著影響。

總之，本研究的結果表明siRNA干擾TWSG1基因表達將對人胃癌細胞SGC-7901的增殖產生明顯影響，有顯著促進作用。TWSG1很可能是一種抑癌基因，提示TWSG1基因可能是潛在的胃癌治療靶點。此外由于胃癌與TWSG1的相關研究較少，因此本研究對后續TWSG1基因在胃癌中的功能、分子機制的研究具有重大意義，為胃癌發展的機制研究提供了實驗基礎，為胃癌的個性化治療以及基因治療提供了實驗依據。通過基因篩查可以預判出胃癌高危人群，在臨床治療上未嘗不是一種有效治療手段。