苦參堿自微乳體外抗腫瘤活性研究

郭明興，蘇婷婷，傅春升

(1.山東省衛生健康委員會醫療管理服務中心，山東 濟南 250014；2.濟南市中西醫結合醫院，山東 濟南 250014；3.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014)

肝癌嚴重危害著人類健康,是我國常見的惡性腫瘤之一。根據流行病學資料,我國肝癌的發病率和死亡率占全部惡性腫瘤的第二位,僅次于肺癌[1-2]。苦參堿能夠抑制鼠移植性肝腫瘤[3-6]，但是苦參堿存在普通劑型溶出速度慢，吸收較差等缺陷[7]。自微乳化給藥系統在37 ℃環境下，通過溫和攪拌即可自發乳化成粒徑小于100 nm的微乳[8]。本研究制備苦參堿自微乳和原料藥含藥血清，比較不同含藥血清對腫瘤細胞的抑制、殺傷作用，為苦參堿自微乳治療肝癌提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 CKX-31倒置顯微鏡(Olympus公司)；BIOBASE-EL10A型全自動酶標儀(山東博科)；CO2培養箱(上海勝衛電子科技有限公司)；離心機(奧豪斯國際貿易有限公司)。

1.2 試藥 苦參堿自微乳(自制，含藥量為4.76%)；苦參堿(中國藥品生物制品檢定所，批號：110805-200306)；RPMI-1640培養基；胎牛血清；噻唑藍(MTT)；96孔板；二甲基亞砜(DMSO，批號：201301013，MP Biomedicals公司)。

1.3 腫瘤細胞株和研究對象 HepG2細胞；Wistar大鼠，由濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司提供，體重(220±30)g，動物許可證號：SCXK(魯)20140007。

2 方法

2.1 苦參堿自微乳的制備 自微乳處方：苦參堿∶油酸∶油酸乙酯∶EL-40∶異丙醇=0.5∶1.5∶1.5∶3.5∶3.5。稱取處方量的油酸、油酸乙酯、EL-40、異丙醇，加入到50 mL燒杯中，渦旋混勻至無分層，得空白自微乳液；將處方量的苦參堿加入到空白微乳溶液中，將燒杯置于磁力攪拌器上，轉速100 rpm，攪拌10 min制得苦參堿自微乳液。

2.2 含藥血清的制備 Wistar大鼠分空白組、自微乳組、原料藥組，每組8只，按含藥量60 mg·kg-1劑量灌胃，空白組給予相同體積的蒸餾水，早晚各1次，灌胃21 d，禁食1 d，第22天給藥2 h后，麻醉大鼠，下腔靜脈取血，收集上清，過濾除菌，低溫保存。

2.3 MTT實驗 用對數期細胞制備懸液，調整密度為5×104/mL，吹打均勻。96孔板鋪板，每孔加入100 μL細胞懸液，四周每孔加入200 μL PBS，置于CO2培養箱18 h。設置自微乳組、原料藥組、陰性對照組、空白組，每組鋪6孔。細胞貼壁，棄去培養液，加入含藥血清干預，于CO2培養箱培養24 h和48 h。每孔加5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，培養4 h，棄去培養液，加入150 μL DMSO，恒溫搖床8 min，上機測定吸光值。

2.4 凋亡率測定 設置30%自微乳組、20%自微乳組、30%原料藥組、20%原料藥組、對照組(不加含藥物血清)5組細胞，培養24 h，處理細胞，收集所有懸浮細胞和貼壁細胞，離心機離心，沉淀物重懸計數。加入5 μL AnnexinV-FITC、10 μL碘化丙啶染色液混勻，加MTT溶液10 μL，培養4 h。棄掉培養液，每孔加150 μL DMSO。室溫避光孵育15 min，上機檢測。

2.5 細胞周期檢測 對數期細胞過夜貼壁。棄掉舊培養液，加入20%原料藥血清，30%原料藥血清，20%自微乳血清，30%自微乳血清，設對照組，24 h后收集所有細胞。調整細胞濃度為1×106/mL，取1 mL單細胞懸液。離心，沉淀物用70%乙醇固定，4 ℃保存。加入100 μL RNaseA，37 ℃水浴35 min，400 μL PI染色均勻，4 ℃避光35 min后測定數值。

3 結果

3.1 運用MTT法檢測得的OD值，計算自微乳與原料藥對肝癌HepG2細胞的抑制率，不同血藥濃度血清對肝癌HepG2細胞的影響見表1。

表1 不同濃度含藥血清對肝癌HepG2細胞的影響

注：相同時間點、相同濃度兩組比較，*P<0.05,**P<0.01

結果，自微乳組與原料藥組對肝癌HepG2細胞的抑制作用有明顯差異。干預24 h，20%含藥血清處理細胞，自微乳組的抑制率明顯大于原料藥組；30%含藥血清處理細胞，自微乳組的抑制率明顯大于原料藥組。干預24 h，20%含藥血清處理細胞，自微乳組的抑制率明顯大于原料藥組；30%含藥血清處理細胞，自微乳組的抑制率明顯大于原料藥組。

3.2 苦參堿含藥血清對HepG2細胞的抑制作用具有明顯的時間和劑量依賴性(見圖1)。

圖1 體外抑瘤活性曲線

3.3 凋亡率結果 20%自微乳含藥血清、30%自微乳含藥血清干預HepG2細胞的凋亡率為47.53%、72.19%。20%原料藥含藥血清、30%原料藥含藥血清干預HepG2細胞的凋亡率為31.97%、42.19%。

3.4 流式細胞術檢測細胞周期結果 20%自微乳含藥血清、30%自微乳含藥血清干預HepG2細胞，S期所占比例為15.17%、19.10%。20%原料藥含藥血清、30%原料藥含藥血清干預HepG2細胞，S期所占比例為11.42%、13.11%。

圖2 含藥血清誘導HepG2細胞凋亡

圖3 含藥血清干擾細胞周期

4 討論

張思維等[9]分析數據發現肝癌僅次于肺癌為中國腫瘤登記地區死亡率第二位的癌癥類型。隨著對苦參堿及其制劑研究的不斷深入，苦參堿藥理作用逐漸被發現，其用于治療肝損傷、肝纖維化、肝癌的療效深受醫藥工作者重視[10]。金艷書等[5]研究發現，苦參堿能夠誘導人肝癌細胞凋亡，影響人肝癌細胞周期。細胞凋亡是機體對異常細胞或衰老細胞的有效清除手段[11]。

本研究采用MTT法檢測細胞活力，結果表明：自微乳含藥血清對細胞的抑制作用與原料藥含藥血清對細胞的抑制作用差異明顯。含藥血清作用于細胞的時間越長或含藥血清的濃度越大，其對細胞增殖的抑制作用越大。細胞凋亡率檢測結果表明，相同血清濃度下，自微乳含藥血清組誘導細胞凋亡的能力明顯高于原料藥含藥血清組，且隨著含藥血清濃度的增大，其細胞凋亡率越高。通過自微乳組和原料藥組對細胞周期影響的研究表明，自微乳組的作用顯著高于原料藥組。將苦參堿制備成自微乳化制劑能夠改善苦參堿難溶于水，吸收困難的缺點，明顯提高其在體內的吸收利用率。因此，將苦參堿制備成自微乳化制劑有利于提高苦參堿的生物利用度，為苦參堿自微乳治療肝癌提供理論依據。