龍膽苦苷對大鼠血管平滑肌細胞增殖、遷移的影響

董圣軍，李欣，高天勤，劉寶輝，程春雷，吳恩剛，王玉玖

(1.濱州醫學院附屬醫院，山東 濱州 256603；2.濱州市人民醫院，山東 濱州 255610；3.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南250101)

主動脈夾層(Aortic dissection，AD)是一種非常兇險的疾病，具有起病急驟、臨床表現復雜多樣、死亡率高，預后差的特點[1]。 文獻報道，其年發病率約2.9/10萬，已成為嚴重威脅國人生命健康的重要疾病[2]。在AD發病過程中，主動脈中層變性尤其是血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)密度與分布的改變是重要的病理特征[3]。因此，抑制VSMC增殖、遷移及表象轉換是降低血管疾病發生發展的方法之一。近年來，傳統中藥因來源廣泛、副作用少、病人安全應用歷史長及缺乏耐藥性等優點越來越到關注。龍膽苦苷(Gentiopicro-side，GPS)是龍膽科龍膽屬植物龍膽的主要有效成分，大量的臨床及實驗研究發現，GPS不僅有抗炎止痛[4]、保肝利膽[5]、抗氧化[6-7]等功效，近期研究發現，GPS可抑制心肌細胞肥厚及重構[8]，但在血管平滑肌細胞的作用卻罕有報道。因此，本研究的宗旨在于研究GPS對血管平滑肌細胞增殖、遷移是否存在抑制作用，并對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇4周左右清潔級SD大鼠[合格證號：SYXK(魯)20130019]，雌雄兼用，體質量180～200 g，由濱州醫學院附屬醫院動物中心提供。

1.2 試劑與儀器 PF-3758309 (Pak4特異性抑制劑)、噻唑藍(MTT)購于美國Sigma-Aldrich公司；龍膽苦苷標準品(中國藥品生物制品檢定所)。兔源抗大鼠Pak4、MMP-2、β-actin 抗體均購于美國Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG(中杉金橋生物技術有限公司)；二喹啉甲酸 (BCA)×100蛋白質定量測定試劑盒、組織裂解蛋白提取液、蛋白酶抑制劑均購于上海碧云天生物技術公司；酶標儀(美國Biotech公司)；CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)；生物顯微鏡是日本Olympus公司產品；電泳、濕轉移槽及Western blot發光照相系統為美國Rio-Red公司產品。

1.3 方法

1.3.1 血管平滑肌細胞培養及分組 組織貼塊法培養胸主動脈血管平滑肌細胞。 將大鼠處死后，將胸主動脈取下后剔除外周結締組織，將胸主動脈剪成小塊后放置于培養瓶中，輕輕翻轉培養瓶，使培養瓶底朝上。向培養瓶內加入細胞培養基。將培養瓶放于37 ℃、體積分數為5%的CO2培養箱中孵育3 h，待組織塊貼附于瓶底后，翻轉培養瓶使得組織塊被培養液充分覆蓋。7 d后取出培養瓶，更換培養基，觀察VSMC的生長情況。此后隔天更換細胞培養基，直至細胞長至融合成片。所有操作過程均為無菌操作。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及生長現象，原代VSMC傳代培養第4～6代完成純化后進行分組干預：①對照組：不加特殊處理，僅DMEM培養48 h；②GPS組：給予 200 μg·mL-1GPS培養48 h；③PF-3758309+GPS組：加入PF-3758309(100 μmol·L-1),半小時后再給予200 μg·mL-1GPS培養48 h。

1.3.2 MTT法檢測細胞增殖率 將各組VSMC細胞接種于96孔板，并給予上述干預處理。每組設6個復孔，在37 ℃，5% CO2的細胞培養箱內常規培養48 h后，棄細胞培養液，沖洗后加入MTT的培養液(10 μL)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 mL DMEM。震蕩10 min后用酶標儀計于490 nm波長處測定吸光度(A)值，并重復上述實驗3次。增殖抑制率=(對照組OD值-各組實驗組OD值/對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移率 實驗步驟依據參考文獻[9]。將混勻的血管內皮細胞以5×105均勻種于6孔板內，并鋪滿整個孔板。各組給予上述相應處理后，以P200移液器槍頭垂至于6孔板劃出三條平行的“損傷”。用PBS洗細胞3次，去處劃下的細胞，加入5%胎牛血清培養基后，放入37 ℃ 5% CO2培養箱培養8 h。運用倒置相差顯微鏡(Olympus BX61,Japan)對遷移的各組細胞進行拍照，并計算出劃痕上下界限之間距離的平均值。經對照組的設定為100%。

1.3.4 Western blot法檢測細胞內PAK、MMP-2蛋白表達水平 VSMC細胞的前期培養與干預方案同上。各組細胞處理48 h后用蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，并根據BCA蛋白定量方法所得結果加入各組蛋白樣品。依次通過電泳、轉膜、封閉，然后滴加抗Pak4、MMP-2(1∶1 000稀釋)4 ℃過夜，清膜、孵育對應二抗后，再次洗膜后用配置新鮮發光液進行曝光顯影，Bio-Rad照相系統進行照相并用其附帶的軟件分析蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 GPS對血管平滑肌細胞增殖率的影響 MTT法結果顯示：與對照組相比，GPS組作用細胞后的吸光度明顯降低(P<0.01)；與GPS組相比，PF-3758309+GPS組作用細胞后的吸光度明顯上升(P<0.05)。表明GPS對血管平滑肌細胞的增殖存在一定的抑制作用，而PF-3758309可以逆轉GPS對血管平滑肌增殖的抑制作用(見圖1)。

2.2 GPS對血管平滑肌細胞遷移率的影響 劃痕實驗結果提示：與對照組相比，GPS組細胞劃痕實驗所致“損傷”邊界的距離顯著降低(P<0.01)；而與GPS組相比，PF-3758309+GPS組“損傷”邊界的距離顯著增加(P<0.05)。表明GPS對血管平滑肌細胞的遷移能力存在一定的抑制作用，而PF-3758309可以逆轉GPS對血管平滑肌的遷移能力的抑制作用(見圖2)。

圖2 GPS對血管平滑肌細胞遷移率的影響

2.3 GPS對血管平滑肌細胞內Pak4、 MMP-2蛋白表達水平的影響 Western blot法結果提示：與對照組相比，GPS組細胞內Pak4蛋白表達水平、 MMP-2蛋白表達水平水平明顯降低(P<0.01)；而與GPS組相比，PF-3758309+GPS組細胞內MMP-2蛋白表達水平水平明顯上升(P<0.05)。表明GPS對血管平滑肌細胞內Pak4、MMP-2蛋白表達水平有一定抑制作用，而PF-3758309可以逆轉GPS對血管平滑肌細胞內MMP-2蛋白表達水平的抑制作用(見圖3)。

圖3 GPS對血管平滑肌細胞內Pak4、MMP-2蛋白表達水平的影響

3 討論

主動脈夾層是指主動脈腔內血液從主動脈內膜撕裂處進入主動脈中膜，使中膜分離，并沿主動脈長軸方向擴展，形成主動脈壁的二層分離狀態,是累及主動脈的災難性疾病[10]。引起主動脈壁撕裂的主要因素：①主動脈中層有病理改變(基礎)；②心臟搏動引起的主動脈運動；③左心室射血對動脈壁的沖擊力。囊性中膜壞死、纖維化、彈力纖維變脆是AD特有的組織病理學改變。主動脈中層退行性變被認為是主動脈夾層發病的主要病理基礎[3]。主動脈中層由血管平滑肌(SMC)及膠原纖維、黏多糖等構成的細胞外基質(ECM)。因此，抑制 VSMC 過度增殖、遷移及ECM降解是AD形成過程中的重要環節[11]。而降解ECM最主要的酶——基質金屬蛋白酶(MMPs)在AD的形成過程中起著十分重要的作用。

GPS屬于裂環環烯醚萜苷類化合物，其分子式是C16H20O9，是龍膽屬植物的主要藥效成分之一。GPS的給藥途徑也多種多樣，龍膽根提取物基本都可以溶解在酒精和水中，所以可以將藥物加在酒精酊溶液、酒精溶液和茶中，更容易被患者接受[12]。除了有抗炎、止痛、保肝利膽等作用外。在心血管方面，王戈等[8]發現GPS可抑制心肌細胞肥厚及重構；喬慧蓮等[13]發現，GPS可以減輕缺血再灌注致的心肌細胞凋亡。GPS對血管平滑肌細胞增殖、遷移作用及MMP-2表達量是否存在作用卻罕有研究。在本研究中對血管平滑肌細胞進行MTT實驗、細胞劃痕實驗，結果顯示GPS血管平滑肌細胞的增殖率與遷移率均有一定的抑制作用；在Western blot實驗發現GPS可明顯降低血管平滑肌細胞內MMP-2、PKA的蛋白表達水平。上述結果表明GPS不僅能抑制血管平滑肌細胞的增殖與遷移，更有可能通過降低MMP-2的蛋白表達水平，阻止細胞外基質的降解，進一步增加了主動脈中層結構的穩定性。且GPS對血管平滑肌細胞增殖及遷移的抑制作用可能與Pak4相關。

P21激活激酶(p-21 activated kinase，Paks)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPaSe) Cdc42/Racl、生長因子信號的下游主要靶蛋白，參與細胞內多個信號轉導通路[14]。迄今為止PAK家族共發現6個成員，其中Pak4是首先被發現且目前研究得最深入的成員，它在組織發育過程中及成熟組織中廣泛表達，在細胞的生長、生存、增殖及遷移侵襲中起作用[15]。在心血管方面，Pak4 在心臟胚胎發育過程中是必須的，在胚胎時期高表達 而在成熟后表達量明顯減少[16]。在血管平滑肌細胞中，GPS可明顯降低血管平滑肌細胞內Pak4蛋白表達水平，提示Pak4可能參與GPS對血管平滑肌細胞的增殖與遷移能力的作用。本實驗組通過應用PF-3758309(Pak4特異性抑制劑)發現，GPS對血管平滑肌細胞增值率、遷移率及MMP-2蛋白表達水平。PF-3758309可顯著逆轉由GPS導致的血管平滑肌細胞增殖率、遷移率及細胞內MMP-2蛋白表達水平的抑制作用。進一步提示GPS對血管平滑肌細胞增殖及遷移的抑制作用可能與Pak4相關。

綜上所述，本研究發現GPS對血管平滑肌細胞的增殖與遷移存在一定的抑制作用，其作用機制可能通過抑制Pak4降低血管平滑肌細胞內 MMP-2的表達實現的。上述實驗為GPS防治主動脈夾層病理過程中血管中層重構提供了部分實驗依據。