老年冠狀動脈嚴重狹窄患者血漿miRNA-195表達及其與側支循環形成的關系

盧輝耀 許朝祥 徐訓發

(福建醫科大學附屬第二醫院心血管內科，福建 泉州 362000)

冠心病是一種不可逆的慢性病，主要是由冠狀動脈血管動脈粥樣硬化而引起的血管腔狹窄或阻塞〔1〕。冠狀動脈狹窄程度相近的冠心病患者的臨床癥狀及遠期預后差異較大，這可能與冠狀動脈側支循環密切相關〔2〕。冠狀動脈側支循環是心肌在長期缺血缺氧的基礎上形成的代償機制，可起到保護心室功能的作用〔3〕。微小RNA(microRNA)是近年來發現的一類長度為18～24個核苷酸的內源性小RNA，在多種組織中均有表達〔4〕。miRNA-195是microRNA的一個重要類型，既參與細胞缺氧的調控，也參與機體固有免疫的調節〔5〕，研究表明其與血管內皮細胞的存活和分化具有相關性〔6〕，但miRNA-195與老年冠狀動脈嚴重狹窄患者側支循環的形成報道較少。本研究探討老年冠狀動脈嚴重狹窄患者血漿miRNA-195的表達及其與側支循環形成的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2014年4月至2017年10月福建醫科大學附屬第二醫院收治的68例老年冠心病患者納入老年冠心病組，入組患者均經冠狀動脈造影檢查，存在左前降支、左回旋支、右冠狀動脈單支且冠狀動脈狹窄程度達95%以上。排除合并急性心肌梗死者、冠狀動脈心肌橋者、先天性冠狀動脈畸形者、血液系統疾病者、嚴重肝腎功能不全者、有經皮冠狀動脈介入治療史者及冠狀動脈旁路移植術者。根據Rentrop分級將患者分為側支良好亞組(Rentrop分級≥2)32例和側支不良亞組(Rentrop分級≤1)36例。側支良好亞組男18例，女14例，年齡65～80歲，平均(71.73±6.58)歲，Gensini積分(110.96±34.72)分；側支不良亞組男21例，女15例，年齡65～80歲，平均(72.24±7.32)歲，Gensini積分(63.19±22.04)分。另將同期到福建醫科大學附屬第二醫院體檢的72例體檢健康者納入對照組，其中男39例，女33例；年齡65～80歲，平均(71.26±6.67)歲。老年冠心病組和對照組的性別、年齡比較差異無統計學意義(P<0.05)。本研究經福建醫科大學附屬第二醫院醫學倫理委員會批準，研究對象及其家屬在參與研究前均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2樣本采集 老年冠心病組于冠狀動脈造影術前抽取患者空腹靜脈血5 ml；對照組于體檢當日清晨抽取空腹靜脈血5 ml，均置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，經離心處理后取上清液存于-20℃冰箱中待檢。

1.3試劑與儀器 逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒由美國ABI公司提供；TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；人血管內皮生長因子酶聯免疫分析試劑盒購于美國R&D公司；7500型RT-PCR儀由美國ABI公司提供；分光光度計購于Bio-Rad公司；離心機購于美國Thermo公司。

1.4血漿中miR-195的測定 ①總RNA提取：取2 ml血漿樣本按TRIzol試劑盒說明書提取樣本中總RNA，0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，采用Bio-Rad檢測RNA純度及濃度，另取1 μl RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，將電泳條帶清晰者用于RT-PCR檢測。②逆轉錄反應：按照逆轉錄試劑盒操作說明書進行逆轉錄反應，反應體系為20 μl，于0.1 ml EP管中分別加入10×RT緩沖液1.5 μl、1 μmol/L逆轉錄特異性引物3 μl、100 mmol/L脫氧核苷酸(dNTPs) 0.15 μl、20 U/μl RNA酶抑制劑0.19 μl、50 U/μl MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0 μl、RNA樣品1 μl，然后加DEPC水補至20 μl。反應條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 s，反應后產物置于-20℃保存。miR-195逆轉錄引物序列：5′-TCTCACTGTGTCCGTAAAGTCGGCAACATTGCCGTTTCGCACTC-3′；U6逆轉錄引物序列：5′-CTCTGCAAACGTGCGTTTGTCCA-3′。③RT-PCR反應：按照PCR試劑盒操作說明書進行操作，反應體系為20 μl，包括逆轉錄產物cDNA 1 μl、TaqMan GEx MASTER Mix 10 μl、引物1 μl、雙蒸水8 μl。反應條件：95℃ 10 min，92℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環。采用2-△△CT方法計算miR-195表達水平，以U6為內參，ΔCt值=miR-195Ct值-U6Ct值。miR-195引物序列：正向5′-TCTCACCATGCAAATGCGGGTCATTTAGGA-3′，反向5′-GGTAGTGCAGGTAGTG-3′；U6引物序列：正向5′-CCTGCGGCTTCTGACCT-3′，反向5′-CGAACCTTAAACGTGCTTGT-3′。

1.5血漿中血管內皮生長因子(VEGF)的測定 取2 ml血漿樣本應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測患者血清中VEGF的濃度，分別設置標準孔(加入標準品50 μl)、待測樣品孔(先加入樣品稀釋液40 μl，再加入待測樣品10 μl)及空白孔(不加樣品及酶標試劑)，封板后常溫(37℃)孵育30 min，然后重復洗滌5次，再向標準孔和待測樣品孔各加入50 μl酶標試劑，然后在進行常溫孵育及洗滌(步驟同上)，然后再加入顯色劑、終止液，測量三個孔的吸光度，并于加入終止液15 min內測定VEGF水平。

1.6統計學分析 采用SPSS18.5軟件進行χ2檢驗，t檢驗，Pearson直線相關分析，Logistic回歸分析，采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血漿miRNA-195水平對冠狀動脈側支循環形成的辨別能力。

2 結 果

2.1兩組血漿中miRNA-195及VEGF水平比較 老年冠心病組血漿中miRNA-195及VEGF表達水平均明顯低于對照組(t=5.978、4.871，均P=0.000)，其中側支不良亞組明顯低于側支良好亞組和對照組(t=8.662、11.204，P=0.000；t=7.961、10.812，均P=0.000)，見表1。

表1 兩組血漿中miRNA-195及VEGF水平比較

與對照組比較:1)P<0.05；與側支良好亞組比較:2)P<0.05

2.2血漿miRNA-195表達與老年冠狀動脈嚴重狹窄患者側支循環的相關分析 血漿miRNA-195表達水平與老年冠狀動脈嚴重狹窄患者側支循環呈正相關(r=0.615，P=0.003)，側支循環良好者的血漿miRNA-195水平相對較高。

2.3影響老年冠狀動脈嚴重狹窄患者側支循環的因素分析 多因素Logistic回歸分析提示，血漿miRNA-195水平和Gensini積分是影響老年冠狀動脈嚴重狹窄患者側支循環的危險因素，見表2。

2.4血漿miRNA-195表達對冠狀動脈側支循環形成的辨別能力分析 以血漿miRNA-195表達水平作為檢驗變量，以是否形成冠狀動脈側支循環為狀態變量制作ROC曲線，由ROC曲線可知，血漿miRNA-195判斷老年冠狀動脈嚴重狹窄患者側支循環形成的靈敏度為83.28%，特異度為94.75%，見圖1。

表2 影響老年冠狀動脈嚴重狹窄患者側支循環的因素分析

圖1 血漿miRNA-195相對表達量的ROC曲線圖

3 討 論

miRNA廣泛存在于真核生物中，其主要以基因簇、單拷貝或多拷貝等形式存在〔7〕。miRNA可直接參與調節血管生成，還可對促血管生成因素進行調節，從而起到調節血管生成的作用〔8，9〕。既往研究報道，有多種miRNA在動脈粥樣硬化發展中起到關鍵作用〔10〕，其中miRNA-21、miRNA-16、miRNA-214等呈高表達〔11，12〕，miRNA-145、miRNA-222呈低表達〔13，14〕。miRNA-195是miRNA的一個重要類型，參與細胞缺氧的調控，也參與機體固有免疫的調節，以往的研究表明其與血管內皮細胞的存活和分化具有相關性〔15〕。VEGF在內皮細胞的增殖及遷移中起到促進作用，是一種重要的血管生成調節因子〔16〕。當出現心肌缺血時，一方面可誘發機體炎癥反應，大量炎性因子的釋放可引起血管內皮細胞功能異常，進而影響VEGF的分泌〔17〕；另一方面會出現心肌重塑而引起miRNA表達水平發生改變〔18〕。

本研究結果提示miRNA-195及VEGF可能與老年冠心病的發生發展密切相關。王文峰等〔19〕研究報道顯示，miRNA-195與心血管疾病的發生發展存在相關性，可能為該類患者的臨床治療提供新思路。

本研究結果提示miRNA-195在冠狀動脈嚴重狹窄側支循環形成中發揮重要作用，可作為辨別側支循環形成的評價指標之一。側支循環的建立利于緩解患者心肌缺血癥狀，可縮小心肌梗死范圍，減少心絞痛發作風險，利于患者預后。張嫻等〔20〕研究報道，miRNA-195可通過促使VEGF的大量釋放，進而促進冠狀動脈狹窄側支循環的建立，這與本研究結果一致。