Wnt信號通路介導CIP2A沉默誘導肺癌細胞凋亡

劉喜婷 楊磊 馬琴 顧峰 吳玉強

(甘肅省腫瘤醫(yī)院呼吸腫瘤內科，甘肅 蘭州 730050)

蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(CIP2A)是一種從人胎腦cDNA文庫中克隆出來的基因，其在腫瘤組織中高表達，是一種潛在的癌基因〔1〕。研究顯示，CIP2A不僅可以促進正常的胚胎成纖維細胞發(fā)生癌變，還能夠直接促進腫瘤細胞增殖并誘導具有自我更新能力的前體細胞生長，幫助癌細胞躲避治療引起的細胞老化和衰老〔2,3〕。目前在胃癌、肺癌、結腸癌等組織中均已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CIP2A高表達，并且沉默其表達可以誘導胃癌、卵巢癌等腫瘤細胞的凋亡，而其在肺癌細胞凋亡中的作用尚不明確〔4～6〕。研究表明，CIP2A能夠穩(wěn)定致癌因子c-myc的表達，而c-myc是Wnt信號通路的靶基因，CIP2A可能與Wnt信號通路調控作用有關〔7〕。本實驗通過沉默肺癌細胞中CIP2A的表達，探討沉默CIP2A在肺癌細胞凋亡中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 非小細胞肺癌細胞H1299購自上海博谷生物科技有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-9抗體購自美國Cell Signaling Technology；CIP2A引物和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物均由上海生工合成；CIP2A shRNA慢病毒和shRNA陰性對照慢病毒由北京合生基因科技有限公司構建；CIP2A抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；RPMI1640、胎牛血清購自美國Gibco；Cleaved Caspase-3抗體購自美國ABCAM；β-catenin抗體、c-myc抗體購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒、Realtime PCR試劑盒購自大連寶生物。

1.2慢病毒感染及沉默效果檢測 取H1299細胞，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，細胞接種到6孔板內，觀察細胞生長至40%以后，在每個孔內加入適量的病毒液，同時添加1 ml的RPMI1640，病毒感染復數(shù)為20，在每個孔中加入1.5 μl的聚凝胺polyberne(8 g/L)，混合后，置于飽和濕度、5% CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)箱中孵育1 d后，更換成1.5 ml的細胞培養(yǎng)液，同時加入1.5 μl的1 mg/ml嘌呤霉素puromycin進行篩選，每隔2 d進行換液，篩選7 d后，用Realtime PCR和Western印跡檢測沉默效果。將穩(wěn)定感染靶向CIP2A shRNA的慢病毒細胞記為CIP2A shRNA組，同時把感染shRNA陰性對照慢病毒的細胞記為shRNA-NC組，以不添加病毒的細胞記為Control組。

Realtime PCR檢測沉默效果：取各組細胞，用TRIZOL方法提取細胞中的RNA，步驟同試劑盒，以紫外分光光度計檢測RNA的濃度。用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以SYBR Green進行Realtime PCR，步驟均同試劑盒。CIP2A正義鏈5′-GATAGACTGATTGCTCAGCATCGC-3′，反義鏈5′-ACATACTAGCAAGTGTCCGTGCCTC-3′。GAPDH正義鏈5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，反義鏈5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

Western印跡檢測沉默效果：取各組細胞，在細胞中添加苯甲基磺酰氟(PMSF)/RIPA蛋白裂解液，充分吹打混合裂解以后，4℃環(huán)境離心。取蛋白上清，用二喹啉甲酸(BCA)法定量，保存在-80℃。配制10%分離膠、5%濃縮膠，在每個孔內加入20 μg的蛋白，首先將電壓設置為80 V，電泳約60 min后，蛋白處于濃縮膠和分離膠的交界處，此時蛋白形成一條直線，再把電壓升高到150 V，直至染料到凝膠的底部以后，關閉電源。將凝膠取出，進行濕轉膜，轉膜裝置置于冰上，轉膜的電壓為100 V，轉膜時長為70 min。把磷酸纖維素(NC)膜放在封閉液(300 mg脫脂奶粉溶解在10 ml的TBST)中，室溫孵育1 h。配制含有1∶100 CIP2A抗體的孵育液，將NC膜置于其中，置于4℃中過夜反應。配制1∶5 000的二抗稀釋液，與NC膜在室溫中結合2 h后，以電化學發(fā)光(ECL)方法顯色，采集圖像，分析條帶的灰度值，GAPDH作為內參蛋白，分析各組CIP2A蛋白水平。

1.3沉默CIP2A對肺癌細胞中Wnt信號通路的影響 取各組細胞，以Western印跡方法檢測細胞中Wnt信號通路蛋白β-catenin、c-myc的表達水平，檢測沉默CIP2A對Wnt信號通路激活水平影響，步驟同1.2。 用18 mmol/L的Wnt/β-catenin通路激活劑氯化鋰(LiCl)處理沉默CIP2A后的肺癌細胞記為CIP2A shRNA+LiCl組。

1.4細胞增殖活性檢測 以噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖活性，活細胞中的琥珀酸脫氫酶能夠與MTT結合形成藍色結晶，死細胞不能產(chǎn)生結晶，用二甲基亞砜(DMSO)溶解結晶，檢測570 nm的OD值，OD值與活細胞數(shù)目呈正比。步驟如下：取H1299細胞，接種到96孔板，每個孔中加入4 000個細胞，按照Control、shRNA-NC、CIP2A shRNA、CIP2A shRNA+LiCl分組處理以后，置于培養(yǎng)箱中孵育4 d，期間每1 d取出培養(yǎng)板進行MTT檢測，在細胞中添加MTT溶液，孵育4 h顯色，把孔內的液體吸棄以后，加入150 μl的DMSO終止反應，以570 nm的波長檢測OD值。

1.5細胞凋亡檢測 以膜聯(lián)蛋白(Annexin)-V FITC和碘化丙啶(PI)雙染法測定細胞凋亡。具體步驟如下：Control、shRNA-NC、CIP2A shRNA、CIP2A shRNA+LiCl按照上述方法分組處理以后，培養(yǎng)2 d。用胰蛋白酶消化細胞，以磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞洗滌3次，加入100 μl的結合緩沖液、5 μl的 Annexin V-FITC、10 μl的PI混合后，置于室溫避光反應15 min。用流式細胞儀檢測凋亡變化。

1.6Wnt信號通路激活劑對細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、β-catenin、c-myc蛋白水平影響 Control、shRNA-NC、CIP2A shRNA、CIP2A shRNA+LiCl細胞按照上述方法處理培養(yǎng)2 d以后，以Western印跡法測定細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、β-catenin、c-myc蛋白水平，步驟同1.2。

1.7統(tǒng)計學分析 應用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1沉默CIP2A效果檢測結果 與Control組比較，CIP2A shRNA組CIP2A mRNA和蛋白表達水平明顯下調(P<0.05)，shRNA-NC組CIP2A mRNA和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測CIP2A在各組肺癌細胞中的表達

組別CIP2A mRNACIP2A 蛋白Control組1.00±0.000.78±0.09shRNA-NC組0.98±0.080.79±0.07CIP2A shRNA組0.35±0.051)0.24±0.061)

與Control組比較:1)P<0.05；表2同

2.2沉默CIP2A對肺癌細胞中Wnt信號通路激活水平影響 與Control組比較，CIP2A shRNA組β-catenin、c-myc表達水平均明顯下調(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western印跡測定β-catenin、c-myc蛋白表達

組別β-cateninc-mycControl組0.58±0.060.47±0.05shRNA-NC組0.56±0.090.48±0.08CIP2A shRNA組0.23±0.021)0.16±0.031)

2.3激活Wnt信號通路對沉默CIP2A誘導的肺癌細胞增殖抑制作用影響 與Control組比較，CIP2A shRNA組細胞增殖活性顯著降低(P<0.05)；與CIP2A shRNA組比較，CIP2A shRNA+LiCl組細胞增殖活性顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組肺癌細胞增殖情況及凋亡率比較

與Control組比較:1)P<0.05；與CIP2A shRNA組比較:2)P<0.05；表4同

2.4激活Wnt信號通路對沉默CIP2A誘導的肺癌細胞凋亡影響 與Control組比較，CIP2A shRNA組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與CIP2A shRNA組比較，CIP2A shRNA+LiCl組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 流式細胞術測定肺癌細胞凋亡率

2.5Wnt信號通路激活劑對沉默CIP2A的肺癌細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、β-catenin、c-myc蛋白水平影響 與Control組比較，CIP2A shRNA組β-catenin、c-myc蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平顯著升高(P<0.05)，與CIP2A shRNA組比較，CIP2A shRNA+LiCl組β-catenin、c-myc蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Caspase-3、Caspase-9活化水平顯著降低(P<0.05)。見表4和圖4。

表4 各組β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平比較

1～4：Control組、shRNA-NC組、CIP2A shRNA組、CIP2A shRNA+LiCl組圖4 Western印跡測定β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達

3 討 論

編碼CIP2A蛋白的基因定位于3q13.13染色體上，其DNA的長度為38.8 kb，含有21個外顯子，編碼的蛋白由905個氨基酸組成〔8〕。CIP2A主要存在于細胞質中，核酸序列分析顯示，其mRNA的5′端含有較多的GC堿基，在其3′端含有AATAAA多聚腺苷磷酸化信號和ATTTA序列，參與維持mRNA的穩(wěn)定，CIP2A蛋白的羧基端含有1個卷曲螺旋結構域和2個磷酸化位點，卷曲螺旋結構域中含有2個5肽結構，其氨基酸含有亮氨酸拉鏈結構和Armadillo重復結構，CIP2A蛋白這些結構特點與其參與腫瘤發(fā)生具有密切關系〔9～12〕。CIP2A在腦組織、前列腺組織等良性組織中高度表達，在胃、肺等組織中表達水平較低〔13〕。目前的研究表明，CIP2A在腫瘤中高表達，其可以通過與c-myc等結合影響腫瘤的發(fā)生，下調其表達后可以誘導腫瘤細胞生長抑制，另外，CIP2A還具有促進正常細胞癌化的作用〔14,15〕。本實驗結果表明，CIP2A沉默能夠在體外抑制肺癌細胞的生長，誘導肺癌細胞凋亡，CIP2A在肺癌細胞中可能發(fā)揮癌基因的作用。

Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9是細胞凋亡發(fā)生的促進因子，二者在Caspase凋亡反應中發(fā)揮凋亡執(zhí)行和起始的作用，正常情況下，其以沒有活性的Caspase-3、Caspase-9形式存在于細胞內，只有被活化后才可以發(fā)揮凋亡促進作用〔16,17〕。本實驗結果顯示，沉默CIP2A后的肺癌細胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白水平升高，提示沉默CIP2A促進Caspase介導的肺癌細胞凋亡。

c-myc是目前公認的癌基因，具有調控細胞增殖、分化、凋亡等作用，受到細胞內多種信號及基因的調控作用〔18～20〕。c-myc是Wnt信號通路的下游靶基因，其表達水平的高低可以間接反映Wnt信號通路的激活水平〔21,22〕。目前對于CIP2A調控腫瘤的作用機制研究尚不明確，研究顯示，CIP2A可以直接同c-myc的氨基端結合，抑制抑癌因子PP2A的表達，而PP2A的活性升高可以通過抑制β-catenin復合物的降解阻礙β-catenin進入細胞核，引起Wnt信號通路激活受阻，CIP2A可能具有調控Wnt信號通路激活的作用〔23～25〕。本實驗結果表明，沉默CIP2A后的肺癌細胞中Wnt信號通路激活水平降低，并且Wnt信號通路激活劑可以逆轉沉默CIP2A對肺癌細胞增殖凋亡的影響，沉默CIP2A可以通過降低Wnt信號通路的激活水平誘導肺癌細胞凋亡。CIP2A影響腫瘤細胞的生長、凋亡的機制較為復雜，本實驗初步探討了沉默CIP2A對肺癌細胞凋亡的影響與Wnt信號通路有關，二者是通過何種調控及結合方式尚未研究。

綜上，沉默CIP2A可以誘導肺癌細胞凋亡，抑制肺癌細胞增殖活性，其作用機制與下調Wnt信號通路激活水平有關，對于其是如何靶向調控Wnt信號通路機制尚未探討。本實驗明確了CIP2A在肺癌細胞增殖凋亡中的作用，為靶向CIP2A治療肺癌提供了新思路，為明確CIP2A在肺癌發(fā)生中的機制奠定了基礎。