腦缺血再灌注后內質網應激對聽皮層的損傷作用及機制

呂哲 張穎 時美娟 孟晴 宋永周

(河北醫科大學第二醫院 1耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050000，2骨科)

腦缺血再灌注可導致神經細胞缺氧、酸中毒、大量自由基蓄積及能量耗竭，從而引發內質網應激(ERS)〔1,2〕。但是持久的ERS會激活凋亡通路，細胞凋亡產生，形成惡性循環。作為聽覺系統的最高級中樞，聽皮層屬于大腦皮質的一個亞皮質區域。在臨床工作中許多腦卒中患者會出現聽力缺失〔3〕。由于神經細胞的退行性變和凋亡，很多患者會出現對聲音的處理、認知力下降。在以前的研究中，腦缺血再灌注后聽力損傷研究焦點多數都集中于耳蝸組織學改變，而對中樞系統的改變則研究甚少〔4～6〕。本研究建立局灶性腦缺血再灌注模型，觀察ERS相關因子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-12、葡萄糖調節蛋白(GRP)78在聽皮層的表達變化，探討腦缺血再灌注對ERS及其誘導的凋亡導致聽功能損害的機制。

1 材料與方法

1.1動物分組 將30只健康雄性SD大鼠隨機分為Sham組，缺血再灌注組，每組15只，體重250 g左右，無噪聲暴露史，標準飼料喂養。

1.2試劑和儀器 兔多克隆抗GRP78及Caspase-12抗體(Santa Cruz公司)，2，3，5-三苯基四唑氮紅(TTC，美國Sigma公司)，TUNEL法原位檢測細胞凋亡試劑盒、免疫組化檢測試劑盒(博士德生物工程公司)，羊抗兔IgG抗體(美國Abcam公司)，聽性腦干反應(ABR)電位儀(美國TDT公司)。

1.3方法

1.3.1動物模型制備 大鼠麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，備皮消毒后，于頸部正中行1 cm切口，鈍性分離后顯露胸鎖乳突肌，分離頸總動脈、頸外、頸內動脈，結扎頸外動脈，于距頸總動脈分叉處2 mm剪一小口，插入線拴，進線長度為(18.5±0.5)mm。當感到進線有輕微阻力時停止。扎緊固定插線。阻斷60 min后輕柔拔出線栓。缺血再灌注24 h后進行檢測并處死、取材。Sham組只分離頸部血管，不插入線栓。

1.3.2神經功能缺損評分 采用單盲6級5分法。正常為0分，垂直提尾時對側前肢不能完全伸展為1分；2分：垂直提尾時屈曲對側前肢；3分：行走時輕度向癱瘓側轉圈；4分：行走時嚴重向癱瘓側轉圈；5分：不能自主行走，向對側跌倒。

1.3.3ABR檢測 大鼠麻醉后置于隔聲屏蔽室內，參考、接地電極置于兩側乳突皮下，記錄電極刺入顱頂皮下。選用10 ms短純音作為誘發ABR的刺激信號，上升下降時間為5 ms，重復率21.1次/s〔7〕。從90 dB聲壓(SPL)開始， 5 dB SPL下降一檔。以Ⅲ波反應閾作為ABR聽閾。檢測時間為造模前及造模后24 h。

1.3.4腦梗死體積測定 每組取5只大鼠，斷頭處死后，完整取出腦組織，將大腦沿冠狀面切成5片后置入TTC溶液中，37℃細胞培養箱中溫育30 min。注意每5～8 min將切片翻面使兩面著色均勻。待顯色完全后放入4%多聚甲醛中固定24 h。正常組織表現為均勻紅色，梗死區表現為蒼白區。數碼單反相機拍照，圖像分析軟件測定腦梗死體積。

1.3.5聽皮層組織學改變觀察 大鼠以4%多聚甲醛快速灌注后取腦，切取聽皮層后石蠟包埋切片。后經脫蠟，蘇木素染核，鹽酸酒精分化，伊紅復染胞質，封片后觀察組織學改變。

1.3.6TUNEL檢測凋亡神經細胞 將上述步驟制作的腦組織切片脫蠟至水化，0.3%過氧化物氫封閉內源性過氧化酶活性， 加入蛋白酶K室溫孵育30 min，滴加50 μl TUNEL反應混合液，37℃避光孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入50 μl酶標記抗熒光素抗體，37℃避光孵育1 h。然后加入100 μl二氨基聯苯胺(DAB)底物溶液，蘇木素復染，常規封片觀察。400倍光鏡下隨機取5個不重復視野觀察，計算神經細胞凋亡指數(AI)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。

1.3.7免疫組化法測定Caspase-12、GRP78表達 大鼠麻醉后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋切片。采用免疫組化ABC法染色，DAB顯色，蘇木素復染，封片、鏡檢，采用Image-Pro Plus6.0軟件進行圖像分析。

1.3.8Western印跡檢測 麻醉后迅速取梗死側聽皮層，提取蛋白并測定濃度。每孔加入80 μg總蛋白，經電泳分離，轉膜封閉后加入Caspase-12、GRP78抗體，37℃反應1 h。TBST洗膜，加入羊抗兔IgG抗體，37℃反應1 h ，凝膠成像儀掃描并進行灰度分析，計算各目的條帶相對表達量。

1.4統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1神經功能評分、TTC染色 Sham組行動自如，反應敏捷，飲食正常。缺血再灌注組大鼠食欲差，精神萎靡，出現對側肢體癱瘓，轉圈及不同程度的前肢屈曲等癥狀。兩組神經功能評分差異有統計學意義(P<0.01)，表明缺血再灌注后出現明顯的神經功能障礙。Sham組TTC染色無梗死灶，缺血再灌注組則可見明顯梗死灶，兩組梗死體積差異有統計學意義(P<0.01)，見表1、圖1。

表1 兩組神經功能評分、腦梗死體積、AI比較

圖1 兩組腦組織TTC染色

2.2ABR檢測 Sham組造模前反應閾為(24.83±4.05)dB SPL，造模后為(26.40±5.25)dB SPL，差異無統計學意義(t=-1.143 8,P>0.05)。缺血再灌注組造模前為(24.88±3.80)dB SPL，造模后為(54.60±3.26)dB SPL，差異有統計學意義(t=-23.273 5，P<0.010)。造模前兩組差異無統計學意義(t=-0.333 4，P>0.05)。造模后兩組比較差異有統計學意義(t=-17.608 3，P<0.001)。

2.3HE染色觀察 Sham組細胞形態大致正常(細胞核大而圓，核染色質均勻清楚，核仁明顯)，僅表現為極少量異形細胞(細胞排列稀疏，胞核固縮碎裂，胞質濃縮)。與Sham組相比，缺血再灌注組異形細胞數目增多(圖2)。

圖2 聽皮層神經細胞HE染色(×200)

2.4TUNEL染色檢測細胞凋亡比較 TUNEL染色顯示，Sham組偶見凋亡細胞，缺血再灌注組細胞核濃縮深染，可見凋亡小體、DNA片段化，提示缺血再灌注組誘導了細胞凋亡發生。兩組AI比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3，表1。

圖3 聽皮層神經細胞TUNEL染色(×200)

2.5免疫組化染色檢測Caspase-12、GRP78表達 光鏡下觀察Caspase-12免疫組化染色結果，染色陽性細胞呈深棕色，胞質表達為主。與Sham組比較，缺血再灌注組陽性細胞明顯增多，表達上調(P<0.01)。GRP78抗原陽性細胞呈棕黃色，多數細胞形態有改變。缺血再灌注組表達較Sham組明顯上調(P<0.01)，見圖4、圖5，表2。

2.6Western印跡檢測 Sham組大鼠Caspase-12、GRP78蛋白微弱表達，條帶較弱，缺血再灌注組則表達明顯升高，兩組表達差異比較均有統計學意義(P<0.01)，見圖6，表2。

圖4 聽皮層神經細胞GRP78免疫組化染色結果(×200)

圖5 聽皮層神經細胞Caspase-12免疫組化染色結果(×200)

圖6 Western印跡檢測GRP78和Caspase-12蛋白表達

組別免疫組化染色GRP78Caspase-12Western印跡檢測GRP78Caspase-12Sham組0.287±0.0120.271±0.0140.58±0.220.49±0.05缺血再灌注組0.618±0.0170.750±0.0392.45±0.261.65±0.11t值-35.568 8-25.848 5-12.277 2-21.466 8P值<0.001<0.001<0.001<0.001

3 討 論

腦缺血后損傷內質網，導致ERS，通過多種途徑導致神經元凋亡。當缺血再灌注損傷累及聽皮層時，聽皮層內質網會發生一系列反應而誘發ERS及細胞凋亡，最終影響聽力〔8〕。

課題組研究人員在前期工作中觀察了ERS及相關因子在全腦缺血后聽皮層的表達變化〔7,9〕，為了更進一步貼近臨床實際，更好模擬人類大腦中動脈局灶性腦缺血狀態，改進了實驗方法，采用了操作更簡便，創傷更小的局灶性缺血再灌注損傷模型。同時通過神經評分、TTC染色和形態學觀察證實模型成功。通過ABR證實缺血再灌注后患耳出現了聽力損害。因此我們推測是由于缺血致聽覺中樞的神經元損害進而導致聽力受損。

內質網對維持細胞正常功能非常重要，對各種異常刺激如氧化應激、缺血缺氧及鈣超載等非常敏感，可導致內質網應激，引起細胞內鈣離子紊亂，未正確折疊或錯誤折疊蛋白大量堆積。但時間過長或嚴重的ERS則引起細胞凋亡，因此ERS是缺血再灌注損傷的關鍵環節〔10～14〕。

GRP78是ERS的經典標志蛋白，能夠檢測內質網穩態變化，正常情況下處于失活狀態。當內質網穩態失衡時，大量未折疊蛋白聚集，GRP78隨即被激活，促進未折疊蛋白的正確折疊。我們發現在全腦缺血再灌注12 h后即有GRP78蛋白表達最多，后逐漸下降。隨著再灌注時間延長，內質網功能受到破壞，GRP78表達下降，提示缺血再灌注12 h內對細胞內ERS是比較合適的〔5〕。Caspase-12是內質網途徑誘導凋亡途徑特有的關鍵分子。當ERS發生時，Caspase-12被激活，進一步激活Caspase-9、Caspase-3，導致細胞凋亡〔15～17〕。我們發現造模后聽皮層GRP78及Caspase-12蛋白表達明顯增高，提示缺血再灌注啟動了ERS過程及下游凋亡信號分子，最終導致聽皮層神經元凋亡。

因此，ERS及其介導的凋亡在腦局灶性缺血再灌注后聽功能損傷中發揮著重要作用，基于ERS凋亡通路的相關分子可以進行相應阻斷，將是未來治療伴有腦血管基礎疾病的突發性耳聾患者的新的研究方向。