SiO2@TiO2復合材料分離富集酪蛋白磷酸肽

劉真真，李 榮,*，湯書華，黃賢勇，張萬晶，李勇杰，姜子濤,2,*

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.天津天獅學院食品工程學院，天津 301700）

TiO2作為一種新型的分離分析材料，具有機械強度高、酸堿穩定性好等優點[1]，對堿性化合物沒有不可逆吸附[2-3]，且對磷酸肽等具有較好的選擇吸附作用[4]，在分離分析中具有良好的應用前景，但是比表面積小、孔徑分布不均和孔徑小等方面的缺點大大限制了作為介孔材料的TiO2在色譜填料以及固相萃取（solid phase extraction，SPE）方面的應用[5]。將TiO2與具有大比表面積的材料復合是改善其比表面積的有效途徑，層層自組裝法（layer-by-layer，LBL）便是其中的方法之一[6-7]。LBL是利用靜電作用力將電負性不同的帶電粒子進行結合。研究結果表明，通過LBL合成的核殼型復合材料在生物工程學[8]、電磁信息轉化[9]以及表面工程[10]等方面應用廣泛，在SPE方面的應用還有待拓展。

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）是一種經單一或復合蛋白酶水解牛乳酪蛋白得到的含有磷酸絲氨酸基團的生物活性多肽[11-12]。在堿性條件下，CPPs可防止鈣、鐵等離子的沉淀，從而促進其吸收，因此CPPs被稱為“礦物質載體”[13-16]。現今已有報道的關于CPPs富集的方法主要包括：免疫沉淀法、固定金屬離子親和色譜法、金屬氧化物親和色譜法[17]及強陰陽離子交換色譜法[18]。免疫沉淀法由于成本高，對于分子質量低的磷酸化絲氨酸和蘇氨酸并不適用，目前多應用于從小規模的細胞提取物中進行酪氨酸磷酸蛋白的富集[19]。固定金屬離子親和色譜法是通過帶正電的金屬離子與帶負電的磷酸基團產生靜電交互作用而結合來富集磷酸肽，但這種結合能力在高pH值或磷酸鹽存在的緩沖液中會被破壞，磷酸化肽會被釋放出來[20]。強陰陽離子交換色譜法因其對樣品需求量大、工作量大而應用受限[21]。金屬氧化物親和色譜法不僅可以快速、高效地富集磷酸肽，而且其金屬氧化物（如TiO2）大多具有很好的化學穩定性，故而廣泛應用于磷酸肽富集研究，發展迅速[22]。

本研究利用LBL技術，合成了具有高比表面積、多孔結構的SiO2@TiO2核殼型復合材料，并用于樣品中CPPs的分離富集。通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，LC-Q-TOF-MS）等手段對CPPs進行結構鑒定，采用內標法對CPPs進行定量分析。本研究旨在為食品、藥品中CPPs（特別是低豐度）成分的分離分析提供一個行之有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨糖軟骨素鈣片和嬰兒配方奶粉樣品，購自于天津市內大型購物超市。

CPPs樣品 天津百奧泰科技發展有限公司；甲醇、乙腈（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；SiO2填料（Davisil硅膠，粒徑16～24 μm，孔徑15 nm，比表面積289 m2/g） 美國格雷斯公司；異丙氧基鈦（Ti(OPri)4）安徽省泰昌化工試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium lauryl sulfate，SDS）、氨水、氫氧化鈉、鹽酸天津市科密歐化學試劑有限公司；氟化銨 天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

6520 Q-TOF-MS、1200系列HPLC儀 美國Agilent公司；JEOL場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（配有電子能譜（energy dispersive spectrometry，EDS）附件） 日本電子株式會社；HGC數控SPE儀 上海禾工科學儀器有限公司；F-Sorb 3400全自動比表面積及孔徑測試儀 北京金埃譜科技有限公司；TSX1200紫外分光光度計 西尼特（北京）有限公司；H2050R-1醫用離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SiO2@TiO2復合材料的制備及表征

SiO2@TiO2復合材料參照文獻[23-26]的方法制備并適當改進，具體制備流程如下：

1）SiO2的活化：稱取2 g的SiO2填料放于100 mL三角瓶中，按照10 mL/g的比例向其中加入1 mol/L HCl溶液，45 ℃超聲30 min后轉移至恒溫振蕩器中，45 ℃恒溫振蕩12 h，然后進行抽濾，沉淀用去離子水洗至中性，80 ℃真空干燥4 h，冷至室溫，即得到活化后的SiO2；2）有機分子膜組裝：將活化后的SiO2浸入到100 mL濃度為0.05 mol/L的SDS溶液中，超聲30 min，抽濾、蒸餾水洗滌，除去未吸附的SDS，80 ℃真空干燥5 h后冷至室溫，得到SiO2@SDS；3）TiO2的組裝：將SiO2@SDS浸入TiO2溶膠中（該溶膠按照文獻[2]的方法制得），在溫度為15 ℃條件下，恒溫磁力攪拌3 h，靜置陳化12 h，離心去除上清液，用無水乙醇洗滌3 次，80 ℃真空干燥5 h后冷至室溫，得到SiO2@SDS@TiO2復合材料；4）多層復合材料組裝：將步驟3）中得到的SiO2@SDS@TiO2復合材料浸入到100 mL 0.05 mol/L SDS溶液中，之后重復步驟2）、3）的操作，即可制備包覆多層的SiO2/SDS/TiO2復合材料；5）SiO2@SDS@TiO2復合材料煅燒：將所制備SiO2@SDS@TiO2復合材料置于馬弗爐中煅燒，以0.5 ℃/min升溫速率升溫至350 ℃并維持3 h，除去復合材料中的有機物，即可制備出SiO2@TiO2復合材料。

通過改變TiO2溶膠與SiO2的比例、陳化時間、包覆層數和煅燒溫度等的單因素試驗，確定采用LBL法制備SiO2@TiO2核殼型復合材料的最佳條件。對所制備的SiO2@TiO2復合材料，采用SEM、EDS進行表征，并利用氮吸附-脫附法（Brunauer-Emmett-Teller，BET）測定所制備的SiO2@TiO2復合材料的比表面積及孔徑。

1.3.2 SiO2@TiO2復合材料SPE柱的制備與對CPPs的富集

1.3.2.1 配制1.0 mg/mL的CPPs樣品液

稱取0.100 0 g CPPs樣品粉末置于燒杯中，加1.5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，在超聲條件下使之溶解，然后將溶液轉入100 mL容量瓶中，超純水定容至刻度。

1.3.2.2 SPE柱填裝及預處理

首先在SPE柱底端裝入聚丙烯篩板，再稱取2.0 g的SiO2@TiO2復合材料填裝于3 mL SPE柱內，之后在SPE柱頂部裝入聚丙烯篩板。接著將SPE柱安裝在數控SPE儀上，對SiO2@TiO2復合材料進行預處理，預處理的具體方法為：先用0.1 mol/L的NaOH溶液對SPE柱進行淋洗，并用超純水洗滌至中性；然后用0.1 mol/L HCl溶液對SPE柱進行淋洗，再用超純水洗滌至中性；最后用甲醇淋洗。以上活化過程均在0.5 mL/min流速下進行。

1.3.2.3 CPPs的富集

將SPE儀的流速設定為0.2 mL/min。向SPE柱中加入1.0 mg/mL的CPPs溶液，收集24 min（約2 倍柱床體積）流出液并標記；然后用超純水淋洗SPE柱，收集淋洗液并標記，再用0.3 mol/L的氨水進行洗脫，收集24 min洗脫液并標記，并將流出液、淋洗液及洗脫液于冰箱中4 ℃保存，在進行HPLC和LC-Q-TOF-MS分析之前，需經0.22 μm濾膜過濾。

1.3.3 CPPs吸附率及解吸率的測定

將1.3.2.3節得到CPPs樣品液原液、流出液及洗脫液進行HPLC分析，HPLC條件參照文獻[27]并加以改進，流動相為甲醇、20 mmol/L氟化銨體積比7∶93；柱溫為45 ℃；等度洗脫，流速為0.8 mL/min；檢測波長為280 nm；色譜柱為Vydac 218TP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

利用原液中CPPs的峰面積與質量濃度之比等于洗脫液中CPPs的峰面積與質量濃度之比，求出洗脫液中CPPs的質量濃度，以此類推可分別計算出流出液、洗脫液中CPPs的質量濃度，再按公式（1）、（2）求算出SPE柱對CPPs的吸附率與解吸率。

式中：E表示吸附率；ρ1、ρ2、ρ3分別表示樣品液、流出液、洗脫液中的CPPs質量濃度/（mg/mL）；V1、V2、V3分別表示樣品液、流出液、洗脫液的上樣體積/mL；D表示解吸率。

1.3.4 LC-Q-TOF-MS對富集后的CPPs結構的分析鑒定

LC條件：Vydac 218TP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為體積分數15%乙腈水溶液，采用等度洗脫的方式進行；柱溫45 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。MS條件：電噴霧離子源；正離子模式；離子源溫度：350 ℃；霧化氣流速：10 L/min；噴霧器壓力：30 psig；電壓：175 V；透鏡：65 V；離子噴霧電壓：4 000 V；一級MS質荷比范圍：m/z 60～3 200；二級MS碰撞能量數據設置見表1；檢測范圍：m/z 50～3 000；母離子優選價態：2、3、大于3。所得信息利用Mascot軟件進行檢索，鑒定匹配肽鏈中的氨基酸鏈接順序。

表1 二級MS碰撞能量設置Table 1 Collision energy setting of tandem mass spectrometry

1.3.5 內標法測定樣品中CPPs的含量

1.3.5.1 內標工作曲線的制作

采用內標法測定CPPs的含量，選擇茶堿作為內標物。配制1.0 mg/mL茶堿標準液，經天津市食品生物技術重點實驗室自制SiO2@TiO2復合材料填裝的SPE柱富集后得到茶堿的洗脫液，將洗脫液分別稀釋50、100、200、300、400、500 倍體積，得到一系列質量濃度的茶堿標準液。再取1.0 mg/mL CPPs樣品洗脫液分別加入到1.0 mL一系列質量濃度的茶堿標準液中，混合，過0.45 μm的濾膜，然后進行HPLC分析。據公式（3）計算出不同稀釋倍數的茶堿洗脫液中茶堿的質量，以茶堿質量為橫坐標，以茶堿與CPPs的峰面積之比為縱坐標，得到內標工作曲線。

式中：m表示茶堿的質量/μg；ρ表示茶堿的質量濃度/（mg/mL）；V表示加入的茶堿的體積/mL；E表示SPE柱的吸附率/%；D表示SPE柱的解吸率/%；n表示稀釋倍數。

1.3.5.2 樣品前處理

對于CPPs樣品，依照1.3.2.1節的方法制成1.0 mg/mL的樣品溶液。對于鈣片和奶粉樣品，前者需用研缽研磨成約40 目的粉末，后者可直接使用。分別稱取0.500 0 g粉碎后的鈣片或奶粉樣品，加適量0.1 mol/L NaOH超聲溶解，然后加入超純水后繼續超聲10 min，抽濾后取濾液進行離心，將上清液轉入100 mL容量瓶，超純水定容并搖勻，得到5.0 mg/mL鈣片及奶粉的樣品溶液。依照1.3.2.3節的方法將配制好的樣品液上樣，富集其中的CPPs，再按1.3.3節的HPLC條件將樣品富集前的原液及富集后的洗脫液分別進樣。

1.3.5.3 CPPs成分含量的測定

采用文獻[28]的方法，并據公式（4）計算CPPs的質量，據公式（5）計算出樣品中CPPs的含量。

式中：ms表示洗脫液中CPPs成分的質量/μg；mi表示茶堿的質量/μg；fs表示洗脫液中CPPs的絕對校正因子；As表示洗脫液中CPPs的峰面積；fi表示茶堿的絕對校正因子；Ai表示茶堿的峰面積；ω表示樣品中CPPs的含量/（μg/mg）；ρ樣表示上樣液的質量濃度/（mg/mL）；V樣表示上樣液的體積/mL；E表示SPE柱的吸附率/%；D表示SPE柱的解吸率/%。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 16.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析，用Origin 8.5軟件對實驗數據作圖。

2 結果與分析

2.1 SiO2@TiO2復合材料的表征

2.1.1 SiO2@TiO2復合材料的SEM和EDS表征

從圖1可以看出，內核材料SiO2在包覆前表面是光滑的，當TiO2納米粒子沉積在其表面即被包覆后，SiO2表面變得粗糙，且隨著包覆層數的增加，SiO2表面沉積的TiO2粒子逐漸增多，表面的粗糙程度也越大；當包覆層數達到8 層時，SiO2表面基本全部覆蓋了TiO2粒子，之后再增加包覆層，表面變化不明顯。

由圖2可知，包覆層數由0 層增加到8 層時，硅元素的原子百分比從34.55%降至11.99%，鈦元素的原子百分比從0%升至19.25%；當包覆層數由8 層增加到9 層時，硅元素的原子百分比從11.99%降至10.12%，鈦元素的原子百分比從19.25%升至20.88%，變化趨于平穩。結合圖1、2的結果可以證明包覆層數為8 層時包覆達到飽和。

圖1 不同包覆層數的SiO2@TiO2復合材料的SEM圖Fig. 1 Scanning electron microscope images of SiO2@TiO2 composite with different layers of TiO2 coating

圖2 不同包覆層數的SiO2@TiO2復合材料的EDS分析結果Fig. 2 EDS images of SiO2@TiO2 composite with different layers of TiO2 coating

2.1.2 SiO2@TiO2復合材料的比表面積及孔徑分析

用BET法對包覆8 層合成的SiO2@TiO2復合材料的比表面積及孔徑進行測定，結果見圖3。運用BET法測得的SiO2@TiO2復合材料比表面積為116.26 m2/g。根據SiO2@TiO2復合材料的BET等溫線（圖3A），結合BDDT吸附等溫線理論可知，該材料的吸附特征及出現的毛細管凝結的現象均符合中孔結構的特點，從而說明了SiO2@TiO2復合材料具有多孔結構。從孔徑分布（圖3B）可以看出，SiO2@TiO2復合材料的孔徑主要分布在2～13 nm范圍內，平均孔直徑為8.42 nm，分布較窄并且均勻。

圖3 SiO2@TiO2復合材料的BET等溫線（A）和孔徑分布（B）Fig. 3 Nitrogen adsorption/desorption isotherms (A) and pore size distribution (B) of SiO2@TiO2 composite

2.2 SiO2@TiO2復合材料對CPPs的富集

圖4 CPPs樣品富集前后的分析Fig. 4 Comparative elution profiles of original and enriched CPPs

由圖4可知，流出液保留時間大于5 min時，沒有明顯的色譜峰出現，表明富集之后，樣品中的CPPs基本被SiO2@TiO2復合材料吸附；而洗脫液保留時間在5 min之后的色譜峰響應值較原液增大了1～2 倍，SPE柱對CPPs的吸附率為93.0%，解吸率為81.5%，說明SiO2@TiO2復合材料對CPPs有較好的富集效果。

2.3 利用LC-Q-TOF-MS法鑒定CPPs的結構

從圖5可以看出，所測定的CPPs樣品液有5 個信號較高的色譜峰，此說明CPPs樣品主要是由這5 種化合物構成的。

利用LC-Q-TOF-MS法對CPPs的結構進行了鑒定。在MS分析過程中，磷酸肽的穩定性比較差，由于碰撞誘導裂解，磷酸肽中性磷酸（如H3PO4、HPO3）易丟失[29-30]。其中，磷酸化的Ser和Thr易發生β消除，即丟失H3PO4分子，分子質量減小98 Da[31]。結合得到的離子碎片圖和Mascot檢索的結果，分析確定了洗脫液中的5 種CPPs，據總離子流圖提取出每種CPPs對應的質核比以及每個質核比對應的二級MS碎片等具體參數（表2），各CPPs對應的斷裂結構解析如圖6所示，說明洗脫液中的5 個峰均為磷酸肽，可見SiO2@TiO2復合材料對CPPs具有非常好的富集作用。

圖5 洗脫液總離子流圖Fig. 5 Total ion current chromatogram of the eluent

表2 主要的CPPsTable 2 Major components of CPPs

圖6 CPPs的斷裂結構解析Fig. 6 Fragmentation of CPPs

2.4 SiO2@TiO2復合材料富集CPPs的應用

2.4.1 工作曲線的制作

茶堿與5 種CPPs的工作曲線如圖7所示，據工作曲線可以得出茶堿與每種CPPs對應的線性方程、決定系數R2以及相對校正因子（即組分與標準物質的絕對校正因子之比），如表3所示。

圖7 內標工作曲線Fig. 7 Internal standard working curves

表3 內標工作曲線線性方程及相關參數Table 3 Linear equations with correlation coefficients and relative correction factors from internal standard working curves

2.4.2 樣品的測定及加標回收率

由圖8A可以看出，CPPs樣品洗脫液在5 min后出現5 個響應值明顯大于CPPs原液的峰，結合LC-Q-TOF-MS的結果可知，圖8A中這5 個峰均為CPPs。由圖8B可知，鈣片樣品洗脫液在保留時間分別為7.4 min和10.8 min時色譜峰響應值均明顯大于鈣片樣品原液的色譜峰，這兩個時間分別對應PHS*、PS*SRS*EP的保留時間，可以得出保留時間在7.4 min和10.8 min的成分均是鈣片中的CPPs。由圖8C可知，奶粉樣品洗脫液在保留時間為7.4 min時色譜峰響應值大于奶粉樣品原液，且與PHS*的保留時間一致，可以得出保留時間在7.4 min的成分是奶粉中的CPPs成分。圖8中14.3 min處均為茶堿富集前后的色譜峰。

圖8 樣品富集前后的分析Fig. 8 Chromatograms of original and enriched CPPs from real samples

加標回收實驗的結果如表4所示。CPPs樣品、氨糖軟骨素鈣片和嬰兒配方奶粉中CPPs的含量分別為2 676.3、174.6、38.7 mg/100 g，平均加標回收率分別為95.1%、94.4%和92.5%。加標回收實驗結果說明，用茶堿作內標測定樣品中CPPs含量的方法有良好的精密度和準確度。

表4 樣品中茶堿加標回收實驗結果Table 4 Recoveries of CPPs from real samples spiked at different levels with the internal standard theophylline

3 結 論

本研究采用LBL法制備出了性能優良的SiO2@TiO2核殼型復合材料，在利用SiO2@TiO2復合材料填充的SPE柱富集磷酸肽的基礎上，通過HPLC分析得到其對CPPs的吸附率為93.0%，解吸率為81.5%；又通過二級MS確定了CPPs樣品洗脫液中的5 種磷酸肽成分，分別為PS*H、PS*PR、S*SRS*E、PHS*、PS*SRS*EP；同時建立了以茶堿為內標測定樣品中CPPs含量的方法，結果表明制備的SiO2@TiO2復合材料對CPPs具有較理想的富集效果，內標法測定樣品中CPPs的含量方法可靠。