珠磨法破碎小球藻提取類胡蘿卜素的動力學及能量消耗分析

陸孔泳，謝友坪,2,3,*，趙旭蕊，賀詩欣，陳劍鋒,2,3,*

（1.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108；2.福建省海產品廢棄物綜合利用工程技術研究中心，福建 福州 350108；3.福州市海產品高值化利用行業技術創新中心，福建 福州 350108）

小球藻是普生性單細胞綠藻，具有光合作用效率高、生長速率快等特點，同時在一定培養條件下，藻細胞還可高效積累某一細胞成分，如蛋白質、多糖、油脂和色素等[1]，因此在醫藥、食品及飼料等領域具有廣闊的應用前景[2-4]。藻色素如葉綠素是天然的解毒劑，可以促進人體排毒、改善健康狀況、緩解潰瘍等；類胡蘿卜素可作為天然著色劑和抗氧化劑用于食品、化妝品和醫藥產品等。但這些藻細胞成分大多位于細胞內，分布于細胞質、細胞器中或結合于細胞膜上，被堅韌的細胞壁所包裹，若要高效提取這些有效成分，就必須先對藻細胞進行破碎處理[5-6]。

目前用于細胞破碎的方法較多，如微波破碎、超聲破碎、高壓勻漿破碎、珠磨破碎、化學法破碎、凍融法破碎、酶法破碎等[7-9]，但能規模化或應用于工業的細胞破碎方法較少，其中珠磨破碎、高壓勻漿破碎和超聲破碎法被認為是幾種易于放大的細胞破碎方法[7-8,10-11]。Lee等[12]在提取微藻油脂過程中，比較了6 種破碎方式對Botryococcus braunii細胞中油脂萃取的影響，發現采用珠磨破碎法可獲得最佳的油脂萃取效率。Chan等[13]研究表明相比超聲破碎法，采用珠磨破碎法破碎Scenedesmus obliquus CNW-N細胞可獲得最佳的細胞破碎效果。Utomo等[14]在提取微藻葉黃素過程中，發現研磨法對Chlorella sp. ESP-6細胞的破碎效果要優于超聲破碎和微波破碎法。Xie Youping等[15]比較了6 種細胞破碎方法對Desmodesmus sp. F51細胞破碎的影響，結果表明采用珠磨破碎法的細胞破碎效果最佳，其次為高壓勻漿破碎法。因此，相比于其他細胞破碎方法，珠磨破碎法對各種微藻細胞的破碎效果普遍較好，而且珠磨破碎法已成功規模化應用于工業微生物細胞破碎過程[16]。

一般而言，對于大多數生物產品的下游加工過程，其成本投入可占到總成本投入的60%左右[17]。雖然藻細胞破碎過程可顯著提高藻細胞成分的提取效率，但其細胞破碎過程中的能量輸入卻不容忽視[18]。藻細胞組分種類較多，在開發利用過程中，可根據組分特性、生產規模、生產成本及提取方法差異選擇合適的細胞破碎程度[9]，從而達到提高提取效率、減小能耗、降低生產成本的目的。Angles等[19]采用高壓破碎法破碎Nannochloropsis sp.藻細胞，當細胞破碎率為84%時，其油脂萃取得率可達50%。Shun等[20]研究了Botryococcus braunii藻細胞的破碎程度對碳水化合物提取率的影響，分別采用循環粒子干擾器、高壓均質機破碎藻細胞，發現其細胞破碎程度分別達2.2%～9.3%、27%～55%時，二者均可明顯提高碳水化合物提取率。Grossmann等[21]采用高壓均質機破碎Chlorella protothecoides細胞，在藻細胞破碎程度達99.9%時，其可溶性蛋白和不可溶性蛋白提取量分別達（46.3±0.1）、（67.2±1.0）g/100 g。因此，有必要進一步優化珠磨破碎過程，分析其細胞破碎過程的動力學情況，同時結合能量消耗分析細胞破碎程度對細胞有效成分提取的影響，為降低藻細胞破碎過程的成本投入提供指導依據。

本實驗以小球藻冷凍干燥藻、濕藻細胞為研究對象，采用珠磨法破碎藻細胞，以葉綠素釋放量為指標評價細胞破碎程度，分析其細胞破碎過程的動力學情況，同時結合能量消耗分析細胞破碎程度對類胡蘿卜素提取的影響，旨在為小球藻的細胞破碎過程及其有效成分的開發利用提供理論參考和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻（Chlorella sorokiniana）購自中科院水生生物研究所淡水藻種庫，編號為FACHB-275。采用BG-11培養基培養小球藻細胞，在光照強度150 μmol/（m2·s）、溫度26～28 ℃、通氣速率0.15 m3/（m3·min）、連續供應2.5% CO2作為唯一碳源的條件下培養6～7 d，收獲藻細胞，即獲得濕藻細胞。將所收獲藻體置于冷凍干燥機中干燥24 h即獲得冷凍干燥藻細胞。

0.5 mm玻璃珠 上海奧然科貿有限公司；乙醇、氫氧化鉀（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AB104N電子天平 德國Sartorius公司；U-2001紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；TDL-40B低速臺式大容量離心機、TGL-16G高速離心機 上海安亭科學儀器廠；Minibeadbeater-16研磨珠破碎儀 美國Biospec公司；RCT B S25型磁力攪拌器 德國IKA公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；FD-1C-50冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；SCILOGEX MX-S多功能漩渦混合器 北京卓信偉業科技有限公司；NanoBrook Omni多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀 美國布魯克海文儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 珠磨法破碎小球藻細胞

采用Minibeadbeater-16研磨珠破碎儀，以蒸餾水為溶劑，選取細胞破碎過程中的關鍵因素：藻液體積/mL∶研磨珠質量/g（10∶1、10∶3、10∶5、10∶7、10∶9）、藻細胞質量濃度（10、40、80、120、160、200、240 g/L）和破碎時間（1、3、5、7、9 min）進行細胞破碎實驗，考察不同操作條件下的細胞破碎率。

1.3.2 葉綠素釋放量和細胞破碎率的測定

利用細胞破碎過程中葉綠素的釋放量來測定細胞破碎率[11,22]。將1 mL 細胞破碎液置于12 000 r/min條件下離心1 min，取50 μL上清液與950 μL無水乙醇混勻。以體積分數95%乙醇為空白對照，分別在664 nm和649 nm波長處測定樣品的光密度值，根據公式（1）～（4）計算藻體葉綠素釋放量和細胞破碎率。

式中：ρChla和ρChlb分別為葉綠素a和葉綠素b的質量濃度/（mg/L）；ρBiomass為藻體細胞質量濃度/（g/L）；XChl,0和XChl分別為細胞破碎前和破碎后葉綠素的釋放量/（mg/g）；XChl,max為細胞破碎后葉綠素的最大釋放量/（mg/g）；RChl為細胞的破碎率/%。

1.3.3 比能量消耗的計算

比能量消耗（每克藻細胞破碎所需要消耗的能量）[15]可根據公式（5）計算。

式中：E為破碎過程中的比能量消耗/（kJ/g）；P為破碎機功率/kW；t為破碎時間/s； m為藻粉的質量/g。

1.3.4 細胞破碎率的動力學擬合

在珠磨破碎小球藻細胞過程中，由于圓盤的高速旋轉，細胞懸浮液和珠子相互攪動，細胞的破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動而引起的，破碎作用遵循一級動力學定律[23]（式（6））。

式中：X為t時刻葉綠素的釋放量/（mg/g）；Xm為細胞100%破碎時葉綠素釋放量/（mg/g），k為一級反應速率常數。

將該方程進行積分，可得到式（7）。

式中：R是被釋放葉綠素的比例（破碎率）。

1.3.5 類胡蘿卜素提取量的測定

采用Chan等[13]報道的方法萃取藻細胞類胡蘿卜素。往破碎后的藻液中加入氫氧化鉀至體系中氫氧化鉀質量分數為60%，將樣品置于40 ℃條件下，水浴40 min，之后加入無水乙醚進行類胡蘿卜素萃取，重復萃取步驟，直至乙醚層無色。最后，使用氮氣將乙醚萃取液吹干，加入丙酮進行重懸，在444 nm波長處測定光密度值。根據式（8）計算藻體類胡蘿卜素提取量[24]。

式中：ρ類胡蘿卜素為類胡蘿卜素提取量/（mg/L）。

1.3.6 藻細胞粒徑分布的測定

選取不同細胞破碎率（0～100%）的藻液，用蒸餾水稀釋至一定濃度后置于多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀上測定其粒徑分布情況。

1.4 數據分析

采用Origin 8.5軟件對實驗數據進行統計學分析、非線性擬合和數據圖繪制。

2 結果與分析

2.1 藻液體積/研磨珠質量對小球藻細胞破碎率的影響

圖1 不同藻液體積/研磨珠質量對小球藻細胞破碎的影響Fig. 1 Effects of algal/bead ratio on cell disruption of Chlorella sp.

由圖1可知，藻液體積/研磨珠質量從10∶1降低至10∶7時，冷凍干燥藻和濕藻細胞破碎率均呈現明顯上升趨勢；但進一步降低至10∶9時，其細胞破碎率均提高不明顯。分析原因可能是由于隨著藻液體積/研磨珠質量的減小，研磨珠與藻體細胞之間的碰撞次數和頻率明顯提高，從而有利于細胞破碎[25]；但當藻液體積/研

磨珠質量過小時，研磨珠之間由于摩擦產生的熱量也越高，而用于細胞破碎的能量也就有所減少，使其達不到適合細胞破碎的速率分布，從而導致細胞破碎率提高不明顯[25-26]。同時，考慮到由于濕藻細胞為完整細胞形態，而冷凍干燥藻細胞其細胞壁結構在冷凍干燥過程中會在一定程度上被破壞，導致其細胞壁堅硬程度有所削弱，因此在相同藻液體積/研磨珠質量條件下，濕藻細胞的破碎率相對較低。

2.2 藻細胞質量濃度對小球藻細胞破碎率的影響

圖2 不同藻細胞質量濃度對小球藻細胞破碎的影響Fig. 2 Effects of cell concentration on cell disruption of Chlorella sp.

由圖2可知，當冷凍干燥藻細胞質量濃度由10 g/L提高至120 g/L時，對其細胞破碎過程無明顯影響，但進一步提高至160 g/L時，細胞破碎率由90.51%明顯下降至69.16%；而當濕藻細胞質量濃度由10 g/L提高至80 g/L時，對其細胞破碎過程無明顯影響，但進一步提高至120 g/L時，細胞破碎率由99.58%明顯下降至76.32%。類似地，Bury等[27]使用珠磨破碎法破碎Lactobacillus de lbrueckii ssp. bulgaricus 11842細胞時，發現細胞質量分數在12%～46%（濕質量）范圍內變化對β-半乳糖苷酶的釋放量無明顯影響。Maria-Regina等[28]使用珠磨法破碎酵母細胞時，發現細胞質量分數在20%～60%范圍內對細胞破碎率無明顯影響。當藻液體積/研磨珠質量一定時，隨著藻細胞質量濃度的提高，研磨珠與單位藻體細胞之間的碰撞次數和頻率有所下降，從而導致細胞破碎率降低。而從能量角度分析，當輸入能量一定時，隨著藻細胞質量濃度的提高，單位藻細胞所得到的能量就越少，當這些能量降低至不足以破壞細胞壁時，就會導致其細胞破碎率降低。另外，與濕藻細胞相比，由于冷凍干燥藻細胞的細胞壁結構被部分破壞，因此相同的破碎條件可破碎更高質量濃度的冷凍干燥藻細胞。

2.3 小球藻細胞珠磨破碎過程的動力學分析

在不同藻液體積/研磨珠質量及藻細胞質量濃度下，其細胞破碎率隨破碎時間的變化趨勢分別如圖3～6所示。對于不同的細胞破碎條件，其細胞破碎率均隨破碎時間的延長而呈現上升趨勢。一般而言，藻液體積/研磨珠質量越小或藻細胞濃度越低，其達到相同細胞破碎率時所需的破碎時間就越短。通過動力學分析，可發現一級動力學方程可較好地擬合珠磨破碎過程，決定系數均可達到0.99左右（表1、2）。珠磨破碎過程的反應速率常數k隨藻液體積/研磨珠質量及藻細胞質量濃度降低而呈現上升趨勢（表1、2）。該結果表明降低藻液體積/研磨珠質量或降低藻細胞質量濃度均有利于提高細胞破碎率。

圖3 不同藻液體積/研磨珠質量條件下冷凍干燥藻細胞破碎過程的動力學分析Fig. 3 Kinetic analysis of disruption of lyophilized cells at different algal/bead ratios

圖4 不同藻液體積/研磨珠質量條件下濕藻細胞破碎過程的動力學分析Fig. 4 Kinetic analysis of disruption of wet cells at different algal/bead ratio

圖5 不同藻細胞質量濃度條件下冷凍干燥藻細胞破碎過程的動力學分析Fig. 5 Kinetic analysis of disruption of lyophilized cells at different cell concentrations

圖6 不同藻細胞質量濃度條件下濕藻細胞破碎過程的動力學分析Fig. 6 Kinetic analysis of disruption of wet cells at different cell concentrations

表1 不同藻液體積/研磨珠質量條件下藻細胞破碎過程的動力學參數擬合值Table 1 Kinetic equation parameters at different algal/bead ratios

表2 不同藻細胞質量濃度條件下藻細胞破碎過程的動力學參數的擬合值Table 2 Kinetic equation parameters at different cell concentrations

2.4 不同細胞破碎率對類胡蘿卜素提取量的影響

圖7 不同細胞破碎率對類胡蘿卜素提取量的影響Fig. 7 Effects of degree of cell disruption on carotenoid extraction

圖8 不同細胞破碎率條件下冷凍干燥藻細胞粒徑分布Fig. 8 Particle size distribution of lyophilized cells at different degrees of disruption

圖9 不同細胞破碎率條件下濕藻細胞粒徑分布Fig. 9 Particle size distribution of wet cells at different degrees of disruption

如圖7所示，在不同藻細胞破碎率條件下，類胡蘿卜素提取量隨細胞破碎率的提高而呈現上升趨勢。細胞破碎率從0提高至70%時，冷凍干燥藻、濕藻細胞類胡蘿卜素提取量上升趨勢較為明顯，但當細胞破碎率大于70%時，冷凍干燥藻細胞的類胡蘿卜素提取量幾乎維持不變，而濕藻細胞的胡蘿卜素提取量繼續緩慢上升，直至其細胞破碎率達90%時，其類胡蘿卜素提取量趨于穩定。此時，結合不同細胞破碎率條件下藻細胞粒徑分布可發現（圖8、9），在冷凍干燥藻和濕藻細胞破碎前，其粒徑分布圖有一個明顯峰值，均在7.5 μm左右，為藻細胞正常尺寸大小；而對于不同細胞破碎率，其藻細胞粒徑分布相比破碎前均明顯減小，當細胞破碎率大于70%時，冷凍干燥燥細胞粒徑均集中分布在0～1 μm之間；而對于濕藻細胞，當其細胞破碎率大于90%時，其細胞粒徑才可集中分布在0～0.5 μm之間。

以上結果表明，隨著細胞破碎率的增大，細胞破碎過程實質上就是將更多的完整細胞破碎為較小粒度的細胞碎片，或者將較大細胞碎片進一步破碎成更小粒徑的細胞碎片，以促進細胞內含物的釋放[20]。因此一定程度上提高細胞破碎率有利于提高類胡蘿卜素提取量，但當細胞破碎率大于一定程度時，由于細胞內含物已實現最大釋放，類胡蘿卜素提取量將與細胞破碎率無明顯關系。如圖7所示，當類胡蘿卜素提取量基本相同時，冷凍干燥藻細胞和濕藻細胞的破碎率分別為70%和90%。分析其原因可能是在細胞破碎過程中，當冷凍干燥藻細胞一旦接觸到水，其細胞表面類似海綿的疏松多孔架構極易吸水，使得藻細胞迅速恢復原狀，這時在細胞膜內外瞬間形成較高濃度差，細胞內滲透壓增大，從而促進葉綠素、類胡蘿卜素等組分釋放至破碎液體系中，因此冷凍干燥藻可在較低細胞破碎率條件下實現類胡蘿卜素萃取。綜合考慮，可分別選擇70%和90%細胞破碎率用于冷凍干燥藻和濕藻細胞的類胡蘿卜素提取。

2.5 相同比能量消耗條件下藻細胞質量濃度對類胡蘿卜素提取量的影響

在2.4節的基礎上，選取70%冷凍干燥藻細胞破碎率（此時對應的最低比能量消耗為35.0 kJ/g）、90%濕藻細胞破碎率（此時對應的最低比能量消耗為87.4 kJ/g），考察不同藻細胞質量濃度對類胡蘿素提取量的影響。

圖10 相同比能量消耗條件下不同藻質量濃度對類胡蘿卜素提取量的影響圖10 Effects of cell concentration on carotenoid extraction at the same specific energy consumption

如圖10所示，冷凍干燥藻細胞質量濃度由40 g/L提高至160 g/L時，對其類胡蘿卜素提取量無明顯影響，但當藻細胞質量濃度大于160 g/L時，其類胡蘿卜素提取量會明顯下降。而對于濕藻細胞，其類胡蘿卜素提取量隨藻細胞質量濃度的提高呈現先升高后下降的趨勢，藻細胞質量濃度由10 g/L提高至80 g/L時，其類胡蘿卜素提取過程明顯加快；當藻細胞質量濃度大于80 g/L時，其類胡蘿卜素提取量出現大幅下降趨勢。另外，結合不同比能量消耗、藻細胞質量濃度對細胞破碎率的影響（圖11、12）可知，濕藻細胞破碎過程所需的能量要高于冷凍干燥藻。在不同藻細胞質量濃度、比能量消耗條件下，其細胞破碎率均隨比能量消耗的提高而呈現上升趨勢。當冷凍干燥藻細胞質量濃度在40～160 g/L時，其細胞破碎率與藻細胞質量濃度無明顯關系，而只與輸入的比能量相關。對于10～80 g/L范圍內的濕藻細胞，其質量濃度越高所需的比能量消耗就越小，但當質量濃度高于80 g/L時，比能量消耗呈現相反變化趨勢，即說明在一定程度上提高藻細胞質量濃度有助于提高細胞破碎過程的能量利用效率[15]。

圖11 不同藻細胞質量濃度條件下比能量消耗對冷凍干燥藻細胞破碎率的影響Fig. 11 Effect of specific energy consumption on disruption rate of lyophilized cells at different concentrations

圖12 不同藻細胞濃度條件下比能量消耗對濕藻細胞破碎率的影響Fig. 12 Effect of specific energy consumption on disruption rate of wet cells at different concentrations

綜上可知，冷凍干燥藻細胞質量濃度在40～160 g/L時，只要保證整個破碎體系中的比能量消耗相同，均可達到較為一致的細胞破碎率及類胡蘿卜素提取效果；而濕藻細胞質量濃度在80 g/L時，可在較低的比能量消耗情況下達到較高的細胞破碎率及類胡蘿卜素提取量。分析其原因可能是冷凍干燥藻細胞質量濃度在40～160 g/L、濕藻細胞質量濃度在80 g/L時，在輸入比能量相同的破碎體系中藻細胞與玻璃珠之間保持動態平衡，即可維持藻細胞與研磨珠之間較適合頻率的碾壓、碰撞與剪切，由此可達到較穩定的細胞破碎程度及類胡蘿卜素提取量。但當冷凍干燥藻細胞質量濃度大于160 g/L、濕藻細胞質量濃度大于80 g/L時，破碎體系中黏度上升，造成研磨珠與藻液黏連，致使研磨珠在藻液中的運動速度銳減，其與藻細胞間的碾壓、碰撞、剪切作用也會削弱[29]，此時即使再多的比能量輸入到破碎體系中，其能量也將用于研磨珠本身的運動，而非用于與藻細胞間的相互作用，從而導致細胞破碎率及類胡蘿卜素提取量的下降。綜合考慮，在保證整個破碎體系中比能量消耗較低的同時又可獲得較高的類胡蘿卜素萃取效率，冷凍干燥藻細胞質量濃度應控制在40～160 g/L，而濕藻細胞質量濃度應選取80 g/L。

3 結 論

采用珠磨破碎法破碎冷凍干燥藻和濕藻細胞，發現一級動力學方程均可較好地擬合小球藻細胞珠磨破碎過程。在類胡蘿卜素提取過程中，冷凍干燥藻和濕藻細胞的破碎率分別控制在70%和90%時可獲得最佳的提取效率。結合破碎過程的能量消耗分析，發現濕藻細胞破碎過程所需的能量消耗要高于冷凍干燥藻。但由于藻細胞在冷凍干燥過程中需消耗額外能量，因此下游加工過程的整體能耗情況還有待進一步評價。但若僅對細胞破碎過程而言，在保證整個破碎體系中比能量消耗較低的同時又可獲得較高的類胡蘿卜素提取效率，冷凍干燥藻細胞質量濃度應控制在40～160 g/L，而濕藻細胞質量濃度應選取80 g/L。本實驗結果可為小球藻的細胞破碎過程及其有效成分的開發利用提供一定的理論參考和實驗依據。