發酵和加工對桑椹抗氧化和降血糖作用的影響

龍曉珊，胡騰根，鄒宇曉，廖森泰*，王思遠，林光月，黎爾納，劉 凡，李 倩

（廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，農業農村部功能食品重點實驗室，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610）

糖尿病是一類以高血糖為特征的代謝性疾病，伴隨著胰島素分泌不足或者胰島素抵抗引起的患者糖脂代謝紊亂，長期的高血糖狀態會使機體的自由基過剩，產生氧化應激反應，對機體胰島細胞造成損傷，降低其胰島素敏感性，從而誘發各種并發癥[1-5]。目前主要通過藥物降低糖尿病患者的血糖水平，提高機體抗氧化能力，達到改善及治療糖尿病的效果[6-9]。但是長期服用藥物會對機體產生毒副作用，而且無法從根本上阻止胰島β細胞的進一步壞死；且部分口服降糖藥效果較差，所以開發新型的降糖藥物很有必要。已有研究將桑葉、桑椹、葡萄籽、蒲公英、柿葉、銀杏葉、苦瓜以及其他植物提取物用于糖尿病治療，并取得了一定的降血糖效果[10-12]，且其具有天然、綠色、對人體無毒副作用等優點。

桑椹作為我國的傳統中藥，位列國家衛生部公布的“既是食品又是藥品”名錄，被譽為“21世紀的最佳保健果品”[13-14]。桑椹營養成分豐富，含有游離脂肪酸、粗纖維、氨基酸、微量元素、維生素以及鈣、磷、鐵、銅、鋅等礦物質成分，富含生物堿、花青素、多酚、黃酮類、多糖等多種活性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂等功效[15-16]。范智義等發現桑椹提取物各組分均表現出一定的抗氧化能力和抗糖基化能力[17]；Chen Chun等發現桑椹多糖具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力，對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶都有抑制作用，證實了桑椹多糖具有抗氧化和降血糖作用[18]。

但是桑椹富含碳水化合物，不利于糖尿病人直接食用。發酵可以通過微生物代謝達到脫除桑椹中碳水化合物的目的。同時，針對加工過程中桑椹發酵液（fermented mulberry，FM）中益生菌損失較大的問題，加入黃豆輔料作為保護劑可以減少冷凍干燥過程中益生菌的失活。同時，黃豆富含異黃酮、卵磷脂、低聚糖、豆甾醇等功能性物質，具有抗氧化和降血糖作用[19-21]。

綜上所述，本實驗對桑椹進行發酵、冷凍干燥以及添加黃豆輔料處理，研究發酵和加工對桑椹抗氧化活性以及降血糖作用的影響，為糖尿病食品的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8～9 成熟的新鮮桑椹品種為‘粵椹大10’，采摘時選取無污染、無病蟲害、成熟度均一的新鮮桑椹。黃豆購自黑龍江北純農產品開發有限公司。

腸膜明串珠菌（Leuconstoc mesenteroides）、葡萄酒高活性干酵母（Saccharomyces cerevisiae）均由廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所菌種保藏中心提供。

硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸（分析純） 天津市福晨化學試劑廠；VC（分析純） 天津市大茂化學試劑廠；無水乙醇（分析純） 南昌市藍翔化工有限公司；甲醇、乙腈（色譜純） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；瓊脂、細菌學蛋白胨、MRS肉湯 廣東環凱微生物科技有限公司；葡萄糖、果糖（標準品）、DPPH 齊云生物技術有限公司；2,2’-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）二銨鹽、鐵離子還原力（ferric ion reducing antioxidant powe，FRAP）試劑盒 碧云天生物技術公司。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋、PX-250B-Z生化培養箱上海博迅實業有限公司醫療設備廠；1200 series高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Sorvall Stratos高速冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司；UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司；萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；Infinite M200PRO酶標儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

腸膜明串珠菌的活化復壯：配制腸膜明串珠菌培養液（5.4 g MRS肉湯、100 mL蒸餾水），于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。待培養液冷卻后，在無菌條件下將腸膜明串珠菌接入其中，在30 ℃搖床中振蕩培養。

酵母菌的活化復壯：配制酵母菌培養液（2.5 g酵母浸膏、5 g葡萄糖、5 g細菌學蛋白胨、250 mL蒸餾水），于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。待培養液冷卻后，在無菌的條件下接入酵母菌，在28 ℃搖床中靜置培養。

桑椹原粉（mulberry powder，MP）的制備：將采摘得到的新鮮桑椹放置在60 ℃烘箱中，48 h后取出，經粉碎機打成粉，過40 目篩，得到顆粒大小一致的MP。

FM的制備：取20 g MP和80 mL蒸餾水于250 mL三角瓶中，用封口膜封住瓶口后放置在高壓滅菌鍋中進行滅菌（121 ℃、20 min）。滅菌結束后，在無菌條件下操作，先接入活化過的腸膜明串珠菌，接種量為3.95×108CFU/mL，放置在30 ℃、150 r/min的搖床中有氧發酵96 h；然后接入活化過的酵母菌，接種量為1.76×105CFU/mL，28 ℃有氧發酵6 h[22]，即得FM。

FM冷凍干燥樣品（freeze-dried fermented mulberry，D（FM））：FM經冷凍干燥后得到D（FM）。

FM添加黃豆輔料后的凍干樣品（freeze-dried fermented mulberry mixed with soybean，D（FM＋S））：發酵液和黃豆按質量比5∶1混合，經冷凍干燥后得到D（FM＋S）。

1.3.2 單糖含量的測定

參考Zheng Xin等的方法[23]并加以適當的改進，將待測樣品用適量的水溶解，超聲輔助提取30 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾后用于高效液相色譜分析單糖含量。色譜條件為：蒸發光檢測器漂移管溫度為45 ℃；色譜柱型號為Shodex Asahipak NH2P-504E（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流動相為體積分數75%乙腈，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL。以葡萄糖、果糖標準品溶液質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算樣品的單糖含量。

1.3.3 菌落總數的測定

腸膜明串珠菌和酵母菌菌落總數的測定采用稀釋平板涂布法，參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》中菌落總數測定方法[24]。按式（1）計算存活率。

1.3.4 發酵和加工對桑椹抗氧化能力的影響

1.3.4.1 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

ABTS陽離子自由基清除能力采用ABTS試劑盒測定。向96 孔板的每個檢測孔加入200 μL ABTS工作液，空白對照孔中加入10 μL蒸餾水，標準曲線檢測孔加入10 μL各種濃度（分別為0.25、0.5、1、2、4、8 mmol/L）的水溶性VE（Trolox）標準溶液，樣品檢測孔加入10 μL樣品（質量濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL），輕輕混勻；室溫孵育2～6 min后測定其在734 nm波長處的OD值。ABTS陽離子自由基清除率計算如公式（2）所示，并計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：OD樣品為樣品孔OD值；OD空白為空白對照孔OD值。

1.3.4.2 亞鐵離子螯合能力的測定

亞鐵離子螯合能力采用FRAP試劑盒測定。向96 孔板的每個檢測孔加入180 μL FRAP工作液，空白對照孔中加入5 μL蒸餾水，標準曲線檢測孔內加入5 μL各種質量濃度（分別為1、2、3、4、5 mg/mL）的FeSO4標準溶液，樣品檢測孔內加入5 μL樣品，以5 μL 0.15～1.50 mmol/L Trolox作為陽性對照，輕輕混勻；37 ℃孵育3～5 min后在539 nm波長處測定OD值。亞鐵離子螯合率計算如式（3）所示，并計算IC50。

式中：OD樣品為樣品孔OD值；OD空白為空白對照孔OD值。

1.3.4.3 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力參考孔凡剛等[25]的方法并加以適當改進，稱取0.004 g DPPH，用無水乙醇溶解并定容至100 mL，保存于棕色瓶中。稱取0.025 g Trolox，用20 mL無水乙醇溶解，配制成5 mmol/L Trolox母液，用無水乙醇將Trolox母液稀釋成1 000、500、250、125、62.5、31.25 μmol/L。測定孔加入20 μL樣品和180 μL DPPH；對照孔加入20 μL無水乙醇和180 μL DPPH；空白孔加入200 μL無水乙醇。將反應液加入酶標板中，避光反應30 min，在酶標儀中測定517 nm波長處的OD值，按式（4）計算DPPH自由基清除率，并計算IC50。

式中：OD樣品為測定樣品孔的OD值；OD對照為對照孔的OD值；OD空白為空白孔的OD值。

1.3.4.4 羥自由基清除能力的測定

羥自由基清除能力采用Fenton體系測定。分別取6 mmol/L硫酸亞鐵和6 mmol/L過氧化氫各2.5 mL，混勻后加入6 mmol/L水楊酸7.5 mL；充分混勻，將體系放置在37 ℃水浴中反應15 min，于510 nm波長處測定吸光度A0，向體系中加入1 mL樣品，37 ℃水浴反應15 min，于510 nm波長處測定吸光度Ax；用蒸餾水作空白對照，VC作陽性對照[26]。羥自由基清除率按式（5）計算，并計算IC50。

1.3.5 發酵和加工對桑椹α-葡萄糖苷酶抑制能力的影響

參照Kumar等的方法[27]并加以改進，向96 孔板中加入50 μL樣品和25 μL 1 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液（用0.1 mol/L pH 6.9磷酸鹽緩沖液配制），充分混勻后于37 ℃反應10 min，加入25 μL 1.5 mol/L對硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷（用0.1 mol/L pH 6.9磷酸鹽緩沖液配制），充分混勻后于37 ℃反應30 min，加入0.2 mol/L碳酸鈉溶液100 μL終止反應，于酶標儀405 nm波長處測定OD值，同時設定相同體系下的樣品背景對照組（不加酶）、空白對照組（不加樣品）。α-葡萄糖苷酶抑制率按式（6）計算，并計算IC50。

式中：OD空白為空白對照組OD值；OD樣品為樣品組OD值；OD背景為樣品背景對照組OD值。

1.4 數據統計與分析

實驗數據表示為 ±s，采用Excel 2010軟件計算。采用Origin 8.0軟件作圖。單因素方差分析采用SPSS 19.0軟件，組間差異比較采用Duncan檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 冷凍干燥和添加輔料對桑椹發酵產物菌落總數和存活率的影響

圖1 冷凍干燥和添加輔料對桑椹發酵產物菌落總數和存活率的影響Fig. 1 Effect of lyophilization in the presence of soybean on microbial populations and survival rate in fermented mulberry

由圖1可知，FM的腸膜明串珠菌和酵母菌菌落總數最大，酵母菌菌落總數為6.90（lg（CFU/mL）），腸膜明串珠菌比酵母菌略高，為7.18（lg（CFU/mL））；FM經冷凍干燥后得到的D（FM），腸膜明串珠菌和酵母菌存活率分別為54.77%、53.40%，說明冷凍干燥對菌體存活率影響很大。D（FM＋S）的菌落總數略低于FM，其中腸膜明串珠菌菌落總數為6.59（lg（CFU/mL）），存活率為91.85%；而酵母菌菌落總數為6.76（lg（CFU/mL）），與FM沒有顯著性差異（P＞0.05），存活率高達97.76%。結果表明通過在發酵液中添加黃豆可以減少冷凍干燥過程中益生菌的損失，起到對益生菌的保護作用。可能的原因是黃豆富含異黃酮、卵磷脂、低聚糖、豆甾醇等功能性物質，其附著在益生菌表面，降低了冷凍干燥過程中低溫對益生菌的影響，提高了益生菌的存活率[19-21]。同時，黃豆營養價值高，富含蛋白質、卵磷脂等多種營養成分，蛋白質量分數高達38%～40%[28]，其中大豆卵磷脂和大豆蛋白可以作為保護劑，減少冷凍干燥過程中益生菌的損失，提高冷凍干燥產品中益生菌的存活率[19,29-30]。

2.2 發酵和加工對桑椹單糖含量的影響

表1 發酵和加工對桑椹單糖含量的影響Table 1 Effect of fermentation and processing on monosaccharide content of mulberry

為明確發酵、冷凍干燥等工藝對桑椹單糖含量的影響，本實驗對桑椹及其加工產物的單糖含量進行分析。如表1所示，MP的果糖和葡萄糖含量分別是10.09、526.41 mg/g；FM和D（FM）中均檢測不到果糖和葡萄糖，這可能是因為果糖和葡萄糖作為腸膜明串珠菌和酵母菌的能源物質被降解利用，轉化為其他物質，降低了桑椹中碳水化合物的含量。周藍波等報道低碳水化合物飲食有利于糖尿病的治療[31]，因此，通過微生物發酵脫糖成為開發降血糖食品的一種新工藝。D（FM＋S）的果糖和葡萄糖的含量分別為0.01、0.47 mg/g，其單糖含量顯著低于未發酵的MP（P＜0.05），但葡萄糖含量比D（FM）略高，其可能的原因是D（FM＋S）中的黃豆含有少量游離葡萄糖。

2.3 發酵和加工對桑椹抗氧化能力的影響

自由基是生物體在新陳代謝過程中產生的、對生物體危害較大、毒性較強的一種自由基，它可使生物體內不同組織中的氨基酸、糖類、蛋白質、核酸等物質發生氧化，導致組織損傷和破壞。Fe2＋會通過Fenton反應引起脂質的過氧化反應，也會通過分解脂類氫過氧化物釋放氧自由基和過氧化氫，加速過氧化反應。樣品對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、羥自由基的清除能力以及亞鐵離子螯合能力可以反映其抗氧化能力，自由基清除能力越強則抗氧化能力越強。

2.3.1 ABTS陽離子自由基的清除能力

圖2 發酵和加工對桑椹ABTS陽離子自由基清除能力的影響Fig. 2 Effect of fermentation and processing on ABTS free radical scavenging capacity of mulberry

圖2 A、B表明，隨著MP、FM、D（FM）、D（FM＋S）質量濃度的增大，樣品對ABTS陽離子自由基的清除能力也增強。研究表明，桑椹具有較強的ABTS陽離子自由基清除能力，且隨質量濃度的增加而增強[32]。4 種樣品對ABTS陽離子自由基的清除能力依次為D（FM）＞D（FM＋S）＞MP＞FM，對ABTS陽離子自由基的IC50依次為1.14、1.26、2.12、2.77 mg/mL，且具有顯著性差異（P＜0.05）；對照Trolox的IC50為0.44 mg/mL，其ABTS陽離子自由基清除能力顯著高于4 種樣品（P＜0.05）。發酵桑椹凍干粉ABTS陽離子自由基清除能力強于未發酵的MP和FM。

2.3.2 亞鐵離子螯合能力

圖3 發酵和加工對桑椹亞鐵離子螯合能力的影響Fig. 3 Effect of fermentation and processing on ferrous ion chelating ability of mulberry

由圖3A、B可知，MP、FM、D（FM）、D（FM＋S）4 種樣品都有一定的亞鐵離子螯合能力，其IC50分別為0.44、0.59、0.25、0.28 mg/mL，除D（FM）和D（FM＋S）間沒有顯著性差異（P＞0.05），其他樣品之間均差異顯著（P＜0.05）。結果表明，D（FM）和D（FM＋S）的亞鐵離子螯合能力最強，其次是MP，FM最弱，但都顯著弱于對照Trolox（0.04 mg/mL）和FeSO4（0.09 mg/mL）。因此，發酵桑椹凍干粉亞鐵離子螯合能力強于未發酵的MP和FM。同時，樣品對亞鐵離子的螯合能力也存在劑量依賴性，樣品質量濃度越大，其亞鐵離子螯合能力越強，與范智義等[17]的研究結果一致，他們發現隨著桑椹提取物濃度的增加，其對亞鐵離子的螯合能力增強。

2.3.3 DPPH自由基清除能力

圖4 發酵和加工對桑椹DPPH自由基清除能力的影響Fig. 4 Effect of fermentation and processing on DPPH free radical scavenging capacity of mulberry

由圖4A可知，MP、FM、D（FM）、D（FM＋S）以及Trolox都有清除DPPH自由基的能力，且清除率隨著樣品質量濃度的增大而增強，與劉丹等[33]的報道一致。D（FM）和D（FM＋S）的質量濃度-DPPH清除率曲線幾乎重合，說明兩者的清除能力相當，但明顯高于同質量濃度的FM和MP。圖4B表明，D（FM）和D（FM＋S）的IC50分別為2.23 mg/mL和2.32 mg/mL，兩者沒有顯著性差異（P＞0.05）；MP和FM的IC50分別為3.40 mg/mL和6.07 mg/mL。由此可知，4 種樣品對DPPH自由基的清除能力強弱依次為：D（FM）＞D（FM＋S）＞MP＞FM。因此，發酵桑椹凍干粉清除DPPH自由基的能力強于未發酵的MP和FM。

2.3.4 羥自由基的清除能力

羥自由基具有極強的得電子能力即氧化能力，而桑椹活性成分中具有巰基、酚羥基等給電子基團，可與羥自由基發生氧化還原反應，從而將其清除。由圖5可知，隨著樣品質量濃度的增大，其對羥自由基的清除率呈上升趨勢，且存在劑量依賴性。江巖等[34]進行了藥桑花青素的體外抗氧化實驗，結果表明藥桑對羥自由基的清除能力與其劑量呈正相關，與本研究結果一致。當D（FM＋S）質量濃度為3 mg/mL時清除率已經大于50%；D（FM）質量濃度為4 mg/mL時清除率大于50%，效果都優于MP和FM。同時，MP、FM、D（FM）、D（FM＋S）的IC50分別為8.13、16.24、3.46、2.54 mg/mL，具有明顯差異。由此可知，D（FM＋S）對羥自由基的清除能力最強，其次是D（FM），FM最弱，且都低于對照VC。所以，發酵桑椹凍干粉清除羥自由基的能力強于未發酵的MP和FM。

由以上實驗結果可知，與未發酵的MP比較，發酵后其抗氧化能力下降，冷凍干燥處理后其抗氧化能力提高，原因可能與其總酚、總黃酮、花青素等活性物質含量有關[35]。桑椹發酵時會產生代謝物，與花青素產生反應，將花青素轉化為其他大分子物質；同時，發酵也會改變其總酚、總黃酮等活性物質的含量，導致其抗氧化能力發生變化[36-37]。曹偉等研究證實，桑椹發酵后花青素含量、DPPH自由基清除率和亞鐵離子螯合率都略微降低[36]。MP是通過烘干的方式得到的，而D（FM）的干燥方式是冷凍干燥，相比于普通的烘干方式，冷凍干燥更能保護桑椹粉總酚、總黃酮等活性物質，降低干燥過程中的活性成分的降解，從而使其抗氧化能力提高[38-40]。因此，發酵桑椹經冷凍干燥的抗氧化能力強于未發酵的MP和FM。

2.4 發酵和加工對桑椹α-葡萄糖苷酶抑制能力的影響

α-葡萄糖苷酶可以將機體攝入的碳水化合物分解成葡萄糖，而其抑制劑可以通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，減少葡萄糖的生成，穩定機體的血糖水平，減少糖尿病的發生[41]。

圖6 發酵和加工對桑椹α-葡萄糖苷酶抑制能力的影響Fig. 6 Effect of fermentation and processing on α-glucosidase inhibitory activity of mulberry

圖6 結果顯示，MP、FM、D（FM）、D（FM＋S）對α-葡萄糖苷酶都有一定的抑制作用，且隨著樣品質量濃度的增加而增大。已有研究表明桑椹具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，其抑制效果與質量濃度存在劑量依賴關系[42]，與本研究結果一致。從圖6A中可以看到，樣品在同一質量濃度下對α-葡萄糖苷酶的抑制作用從強到弱順序依次為：D（FM）＞D（FM＋S）＞FM＞MP。當質量濃度為5 mg/mL時，這4 種樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為91.24%、86.94%、84.44%、83.35%，都超過80%，效果較好。從圖6B中可以看出，MP和FM對α-葡萄糖苷酶的IC50分別為0.58 mg/mL和0.53 mg/mL，兩者沒有顯著性差異（P＞0.05）。而D（FM）和D（FM＋S）的IC50分別為0.19 mg/mL和0.31 mg/mL，差異不顯著（P＞0.05），但均顯著高于MP和FM（P＜0.05）。結果表明，發酵桑椹凍干粉對α-葡萄糖苷酶有較好的抑制效果，明顯優于未發酵的MP和FM。據報道，樣品的α-葡萄糖苷酶的抑制效果越強，其降血糖效果越好[43-47]，因此，發酵桑椹凍干粉對α-葡萄糖苷酶的抑制效果比未發酵的MP和FM好，說明發酵桑椹凍干粉具有更好地降血糖效果。

3 結 論

桑椹經發酵、冷凍干燥處理后，碳水化合物基本被脫除，但是冷凍干燥處理會使發酵桑椹中的部分益生菌失活；而黃豆的添加可以減少冷凍干燥過程中益生菌的損失，起到保護益生菌的作用。發酵桑椹凍干粉對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、羥自由基的清除能力和亞鐵離子螯合能力、α-葡萄糖苷酶的抑制能力都比未發酵的MP和FM強，說明發酵桑椹凍干粉的抗氧化和降血糖能力較強。