核桃對東莨菪堿誘導的小鼠記憶障礙的預防作用

佴逸凡，馮 莉，廖劍橋，馬 琦，伯繼芳，李 梅*，徐懷德*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

隨著人們生活水平的提高，人的壽命逐漸延長，但人口老齡化帶來的老年性疾病越來越多，慢性神經退行性疾病發病率也逐漸增加，其中阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種影響認知和行為的神經退行性疾病，臨床持續時間長，記憶障礙是其最常見的癥狀[1]，常用膽堿能損傷學說來解釋。AD與膽堿能系統中的酶有關，特別是乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）過度分解乙酰膽堿成為乙酸和膽堿[2]，并導致乙酰膽堿缺陷和認知功能障礙。國內外用于治療AD的藥物有膽堿酯酶抑制劑[3]和谷氨酸受體拮抗劑[4]，但藥物具有副作用，且維持時間短[5]。植物性食物安全性高且具有多種營養因子，將其添加到飲食中可以作為預防AD的一種有效方式[6]。植物多酚、黃酮類物質具有營養神經功能，可以用于預防和治療AD[7-10]，Luchtman等的研究表明n-3多不飽和脂肪酸通過促進神經元生長從而恢復認知障礙或神經元缺陷[11]。

中國傳統飲食觀念認為核桃益智健腦。中國是世界上最大的核桃生產和消費國，核桃種植面積達5 000萬 km2，總產量超過300萬 t，而且核桃含質量分數17%的蛋白質和近70%的脂質[12]，其中主要的脂肪酸是油酸、亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸，且比例合適[13]。核桃中還含有許多其他神經保護成分，包括VE、葉酸、褪黑素[14]和高含量的抗氧化多酚[15]。Calcabrini等認為核桃仁提取物作為膳食補充劑可以促進健康，預防以及治療與生活方式有關的氧化疾病[16]。以往的研究表明，在食物中添加核桃可以提高動物的記憶、認知和運動功能[17-19]。

東莨菪堿可通過拮抗毒蕈堿乙酰膽堿受體阻斷中樞神經系統的膽堿能功能[20]，是常用的小鼠學習和記憶能力損傷建模方法[21]。腹腔內注射東莨菪堿不僅可引起記憶障礙，造成海馬中總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶的活性降低，脂質過氧化指標丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量升高，而且可以引起大腦中活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生[22]，大腦中產生過量的ROS將導致神經元功能障礙，進一步導致神經退行性疾病甚至死亡[23]。鄧海峰等用行為學和電生理學等方法證明褪黑素能夠增強乙酰化轉移酶的活性，改善中樞膽堿能系統，對東莨菪堿誘導的大鼠學習記憶障礙有明顯的改善作用[24]。但核桃對東莨菪堿誘導的小鼠學習和記憶能力損傷是否有預防作用仍不清楚。因此，本研究用東莨菪堿建立小鼠記憶障礙模型，將核桃添加到小鼠飼料中，探究核桃對小鼠學習和記憶能力損傷的預防作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級昆明雄性小鼠，體質量28～32 g，由西安交通大學實驗動物中心提供（生產許可證號：SCXK（陜）2012-003）。飼養條件：溫度22～26 ℃、濕度50%～70%，采用12 h晝夜間斷照明。動物自由進食、飲水，適應性飼養1 周。

核桃仁 宜君縣益智源有機核桃開發有限公司；動物飼料 西安交通大學實驗動物中心；吡拉西坦片宜昌人福藥業有限責任公司；氫溴酸東莨菪堿注射液上海禾豐制藥有限公司；蛋白定量試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、MDA試劑盒、T-SOD試劑盒、AChE試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Morris水迷宮視頻分析系統 北京眾實迪創科技發展有限責任公司；T10 basic ULTRA-TURRAX?小型分散機 德國IKA集團；UV-1780紫外-可見分光光度計日本島津公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；超低溫保存箱 中國澳柯瑪股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與給藥

將動物飼料與核桃分別磨成粉末，然后以核桃質量分數6%或9%的比例混勻，加入適量的純凈水攪拌均勻，擠壓成型、烘干，制成核桃質量分數分別為6%和9%的低劑量、高劑量核桃飼料。

將昆明小鼠隨機分為7 組，每組10 只，分別為空白組、核桃高劑量組和低劑量組、模型組、陽性對照組、高劑量核桃預防組和低劑量核桃預防組。陽性對照組灌胃0.01 mL/g（以體質量計）800 mg/kg吡拉西坦[25]，其余組給予等量的純凈水；同時，核桃高劑量組和高劑量預防組、核桃低劑量組和低劑量預防組分別喂食含質量分數9%或6%核桃的飼料。連續喂養8 周，于第8周進行Morris水迷宮行為學測試，在測試前30 min，模型組、陽性對照組、核桃高劑量預防組和低劑量預防組分別腹腔注射0.01 mL/g（以體質量計）3 mg/kg東莨菪堿[26]，建立記憶障礙模型，其余組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3.2 Morris水迷宮行為學測試

Morris水迷宮為直徑120 cm、高50 cm的圓形水池，水溫保持在21～23 ℃，迷宮上方安裝攝像機，記錄小鼠運動軌跡。將水池等分為4 個象限，平臺置于第4象限的中間位置。實驗前，將小鼠放入水迷宮中自由游泳1 min，以適應水溫、熟悉環境。

定位航行實驗：第1天訓練時，將平臺置于高出水面1 cm處，小鼠分別從平臺之外的另外3 個不同的象限入水，每次入水之前在平臺上停留30 s，找到平臺后再停留30 s；對于超過60 s找不到平臺的小鼠，將其引導至平臺后停留30 s。第2～5天，將平臺置于低于水面1 cm處，水中添加黑色素。實驗時將小鼠從不同象限面向池壁放入水中，記錄小鼠找到平臺并停留3 s以上的時間，此為逃避潛伏期。超過60 s找不到平臺的小鼠逃避潛伏期記為60 s，并將其引導至平臺停留30 s。記錄小鼠在訓練期間的逃避潛伏期和找到平臺的游泳總路程。

空間探索實驗：實驗第6天將平臺撤去，其他條件同上，測定小鼠60 s內在平臺所在象限停留的時間、穿越平臺所在空間的次數（穿臺次數），其在平臺所在空間的游泳路程與其游泳總路程的百分比為目標象限路程占比。

1.3.3 生化指標測定

行為學測試后的第2天，所有小鼠禁食不禁水12 h后稱體質量并記錄。斷頭處死小鼠，準確稱取腦組織質量，按料液比1：9加入生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃保存備用。根據試劑盒說明書進行操作，分別檢測各組小鼠腦組織中MDA含量、GSH含量、T-SOD活力和AChE活力。

1.4 數據統計與分析

所有數據均以 ±s表示。使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 核桃對小鼠Morris水迷宮空間記憶影響

2.1.1 定位航行實驗結果

如表1所示，隨著訓練時間的延長，小鼠的運動表現得到改善，所有組小鼠的逃避潛伏期均縮短。方差分析結果顯示，各組小鼠訓練期間的平均潛伏期有顯著差異（P＜0.05），但是沒有觀察到訓練時間和處理方式間的相互作用（P＞0.05）（未在表中顯示）。在整個訓練期間，與空白組小鼠相比，模型組小鼠需要花費更長的時間找到平臺。結果顯示，東莨菪堿處理會對小鼠造成明顯的認知功能障礙。訓練第3～4天，與空白組相比，喂食兩種質量分數的核桃飼料均顯著縮短了小鼠的逃避潛伏期（P＜0.05）。與模型組相比，攝入核桃飼料和吡拉西坦的記憶障礙小鼠的逃避潛伏期在第4天顯著縮短（P＜0.05）。

表1 低劑量和高劑量的核桃飲食對小鼠水迷宮實驗逃避潛伏期的影響Table 1 Effects of low-dose and high-dose walnut kernel on escape latency in water maze test

表2 低劑量和高劑量的核桃飲食對小鼠水迷宮實驗游泳總路程的影響Table 2 Effects of low-dose and high-dose walnut kernel on total distance traveled in water maze test

如表2所示，隨著訓練時間的延長，各組小鼠的游泳總路程逐漸減少。與空白組小鼠相比，在訓練第2天，攝入核桃飼料小鼠的游泳總路程顯著減少（P＜0.05）；模型組小鼠的游泳總路程從第2天起顯著多于空白組（P＜0.05）。喂食核桃飼料后，高劑量核桃預防組小鼠與模型組相比訓練第2～4天游泳總路程顯著減少。

2.1.2 空間探索實驗結果

表3 低劑量和高劑量的核桃飲食對小鼠水迷宮實驗目標象限停留時間、穿臺次數及目標象限路程占比的影響Table 3 Effects of low-dose and high-dose walnut kernel on time spent in target quadrant, number of punctures, and percentage distance traveled in target quadrant

在空間探索實驗中，與空白組相比，攝入高劑量核桃飲食的小鼠在目標象限停留的時間由12.08 s延長至17.79 s（表3），目標象限路程所占比顯著增加至28.38%（P＜0.05）；東莨菪堿處理后的小鼠在目標象限停留的時間縮短至7.03 s（P＜0.05），穿臺次數顯著減少（P＜0.05），且目標象限路程占比顯著減少到14%（P＜0.05）。攝入高劑量核桃飼料的記憶障礙小鼠在目標象限停留的時間為10.48 s，顯著長于模型組（P＜0.05），穿臺次數及目標象限路程占比顯著增加（P＜0.05）。吡拉西坦飼喂也顯著延長了記憶障礙小鼠在目標象限的停留時間，并增加穿臺次數及目標象限路程占比（P＜0.05）。

Morris水迷宮實驗結果表明，喂食核桃飼料可以改善小鼠的學習能力，攝入高劑量核桃飼料的小鼠表現出更好的學習記憶能力。東莨菪堿可以造成空間學習和記憶功能方面的損傷，而核桃可以預防東莨菪堿造成的學習記憶障礙。

2.2 核桃對小鼠腦組織中AChE活力的影響

圖1 核桃飲食對小鼠腦組織中AChE活力的影響Fig. 1 Effect of walnut kernel on AChE activity in brain tissues of mice

如圖1所示，與空白組相比，攝入高劑量核桃飼料小鼠的AChE活力顯著降低（P＜0.05），而東莨菪堿可引起小鼠腦組織中AChE活力極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，喂食吡拉西坦、高劑量及低劑量的核桃飼料可顯著降低記憶障礙小鼠腦組織中的AChE活力（P＜0.05），預防東莨菪堿造成的記憶損傷。其中，高劑量核桃預防組的AChE活力較模型組由1.48 U/mg降低至0.95 U/mg。

中樞膽堿能系統與學習記憶密切相關，乙酰膽堿是重要的神經遞質之一，在學習記憶中起重要作用[27]。AChE作為膽堿能神經元的生理活性特異性標記物的蛋白質，在神經元乙酰膽堿的穩態中發揮重要作用[2]，因此常將AChE活力的變化作為判斷AD的生物標志物。研究結果顯示，腹腔注射東莨菪堿后，小鼠腦組織中的AChE活力升高，表明東莨菪堿不僅可以損傷小鼠的空間學習和記憶功能，還能引起小鼠腦組織中的膽堿能系統功能障礙。高劑量的核桃飲食可以顯著抑制AChE的活力，該結果與小鼠行為數據一致，表明核桃可以通過維持膽堿能系統的穩定來提供神經保護作用。

2.3 核桃對小鼠腦組織中MDA、GSH含量和T-SOD活力的影響

圖2 喂食核桃飼料對小鼠腦組織MDA含量（A）、T-SOD活力（B）及GSH含量（C）的影響Fig. 2 Effect of walnut kernel on MDA level (A), T-SOD activity (B)and GSH content (C) in brain tissues of mice

如圖2所示，與空白組相比，高劑量的核桃飲食可顯著降低小鼠MDA含量，提高GSH含量（P＜0.05）；模型組小鼠腦組織中MDA含量顯著升高（P＜0.05），T-SOD活力及GSH含量顯著降低（P＜0.05）。陽性對照組和高劑量核桃預防組小鼠的MDA含量（分別為11.59、11.65 nmol/mg）顯著低于模型組（P＜0.05），同時T-SOD活力（分別為96.05、93.36 U/mg）和GSH含量（分別為71.29、69.53 mg/g）較模型組顯著升高（P＜0.05）。

氧化應激是AD發病和加重的主要因素之一[28]。SOD、GSH和MDA是氧化應激的3 個主要生物標志物。SOD和GSH是抑制自由基產生的重要的抗氧化劑[29]，MDA是生物膜脂質過氧化的產物，通常被認為是脂質過氧化的標志物[30]。哺乳動物的大腦中，以磷脂為主的脂質約占大腦干質量的60%，且n-3和n-6多不飽和脂肪酸含量豐富，占大腦脂肪酸總量的30%～35%[11]，適當補充二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸可改善老年嚙齒動物認知障礙[31]，長期攝入α-亞麻酸可以調節自然衰老大鼠腦組織中的脂肪酸含量，降低氧化應激反應，保護神經元，改善其學習記憶能力[32]。由于飲食中的n-6/n-3脂肪酸比例過高可引起智力發育遲緩、神經退行性疾病等大腦功能損傷的風險[33]，降低n-6/n-3脂肪酸比例可以調節大腦先天性免疫系統活性，抵抗脂多糖誘導的促炎細胞因子產生和隨后的空間記憶改變[34]。因此保持n-6/n-3脂肪酸比例平衡對大腦發育尤為重要。核桃以約1：4的比例提供的α-亞麻酸和亞油酸，可能對改善記憶障礙小鼠大腦抗氧化能力發揮重要作用[35-36]。

核桃中的多不飽和脂肪酸在改善小鼠記憶及認知能力方面發揮重要作用，其他化學成分也通過改善大腦的抗氧化能力提供了一定的神經保護作用[37]。Aydin等的研究表明核桃中的維生素、類黃酮對腦組織中脂質過氧化物的形成具有保護作用[38]。在山核桃、榛子、核桃、花生、杏仁、腰果、開心果、松子仁等多種堅果中，山核桃中的酚類物質含量最高，總酚含量約為19.4 mg/g[39]，其中主要的酚類化合物為可水解的單寧，約占總酚含量的60.8%，其次是黃烷醇，核桃中還含有沒食子酸、鞣花酸等[40-41]。多酚作為食品中的一種強抗氧化劑可以降低AD的患病風險，預防因年齡增長引起的認知能力下降[42-43]。核桃中的酚類物質顯著降低高膽固醇血癥小鼠腦組織中MDA含量，增加SOD活性，改善小鼠學習和記憶能力[44]。核桃內種皮中的多酚可減輕D-半乳糖導致的氧化損傷，具有一定的抗氧化能力[45]，因此，核桃多酚在減少大腦的氧化應激中可能起到重要作用。

核桃中的褪黑素可以通過直接清除ROS及減少ROS的產生，降低自由基對蛋白質和細胞膜的損害，對大腦中產生的氧化應激具有一定的保護作用[46-48]。同時，褪黑素的神經保護作用與其對細胞凋亡的調節和膽堿能系統的保護有關[49]。長期進行褪黑素處理可以降低大腦的氧化應激水平，提高海馬區SOD活性，降低MDA含量[50-51]，改善認知障礙患者的認知能力，對神經退行性疾病患者具有神經保護作用[52]。

本研究結果顯示，模型組中GSH含量和T-SOD活力顯著低于空白組，MDA含量顯著高于空白組，經喂食核桃飼料干預后，GSH含量和T-SOD活力顯著增加，MDA含量顯著降低。因此，核桃可以改善氧化應激相關因素的變化，保護神經系統免受氧化損傷，可能與其中含有的大量多不飽和脂肪酸、多酚類化合物、褪黑素等其他植物化學物質的協同作用有關。

以上結果表明，東莨菪堿處理可以在學習和記憶功能方面造成損傷，引起小鼠腦組織中膽堿能系統障礙。核桃飲食可以通過提高T-SOD活力、抑制AChE活力，預防由東莨菪堿誘導的認知障礙。

3 結 論

用東莨菪堿建立小鼠記憶障礙模型，通過Morris水迷宮評估小鼠學習和記憶表現，并對其腦組織中的相關指標進行檢測。與模型組相比，在Morris水迷宮實驗中，核桃高劑量預防組的逃避潛伏期在第4天極顯著縮短（P＜0.01），穿臺次數顯著增加（P＜0.05），目標象限停留時間及路程占比分別顯著延長和提高（P＜0.05）。同時，小鼠腦組織中AChE活力（（0.94±0.08）U/mg）、MDA含量（（11.64±0.58）nmol/mg）顯著降低（P＜0.05），GSH含量（（69.53±2.11）mg/g）、T-SOD活力（（93.36±4.94）U/mg）顯著提高（P＜0.05）。結果表明，攝入核桃可以提高小鼠的學習記憶能力，并通過抑制其大腦氧化損傷和增強膽堿能功能，對東莨菪堿誘導的AD模型小鼠的學習記憶損傷發揮保護作用。

根據人與動物等效劑量換算比例，小鼠攝入的質量分數9%的核桃飼料大約相當于成人食用42 g核桃，約4～5 個。因此，核桃可以作為延緩大腦衰老、預防AD發生及延緩其惡化的一種有效方式，然而其中對學習和記憶能力具有保護作用的組分及其作用機制還有待進一步研究。