殼聚糖復合保鮮對草魚肌肉蛋白質變化的影響

陳 賽，劉永樂，俞 健，李向紅，黃軼群，王建輝，王發祥*

（長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南省水生資源食品加工工程技術研究中心，湖南 長沙 410114）

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國“四大家魚”之一，在我國各地均有分布，其肉質鮮美、價格實惠，是我國重要的淡水經濟魚類，2017年全國養殖產量為534.56萬 t，居淡水魚之首[1]。然而，草魚肉水分含量高、組織蛋白酶活性高，保鮮難度較大，宰后貯藏過程中極易腐敗，資源浪費嚴重[2]。目前，國內外研究淡水魚保鮮技術的報道[3-8]較多，新的保鮮方法也層出不窮，但仍無法突破冷藏過程中魚肉鮮度迅速下降和貨架期短的瓶頸。深入研究保鮮處理對宰后貯藏過程中魚肉品質和生理變化的影響，有助于揭示魚肉腐敗機制和針對性制定魚肉保鮮策略。

關于魚肉的腐敗變質，目前普遍認為是由內源酶催化引起的肌肉組織內部生理生化變化和微生物的生長繁殖共同作用引起的[9]，在此過程中，魚肉發生蛋白質降解、脂肪酸敗和糖類發酵。在前期研究中，本課題組通過冷殺菌、復合涂膜等技術將草魚肉冷藏貨架期（以二級鮮度為限）延長至10～12 d[10]，但冷藏期間魚肉軟化、汁液流失問題仍然十分嚴重，表明冷藏過程中肌肉蛋白質的變性、降解等變化是草魚品質下降的一個重要原因。草魚肌肉中蛋白質是其肌肉組織的最重要組成部分，其含量和完整性（分子質量分布）都與魚肉的質構、彈性、持水力等品質指標密切相關[11-12]。目前，國內外對淡水魚的冷藏保鮮研究基本都是對魚肉鮮度等綜合品質進行評價[4-8]，對于魚肉蛋白質在貯藏過程中的變化研究也多集中在其變性、降解和氧化規律，而鮮有單純從蛋白質視角對比分析保鮮和未保鮮處理魚肉在冷藏過程中蛋白質變化規律的研究報道。

本研究以新鮮草魚為對象，利用前期實驗篩選到的最優復合保鮮劑（10 mg/mL殼聚糖＋5 mg/mL茶多酚＋2 000 U/mL溶菌酶）對草魚片進行保鮮處理，分析冷藏過程中保鮮組肌肉蛋白質的分子質量分布、活性巰基含量、表面疏水性等基本性質與未保鮮對照組的差異，為揭示肌肉蛋白質變化與魚肉品質下降的關系補充新的生物學證據，也為更有效的保鮮方法及相關產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚購于長沙本地菜市場，每尾質量為（1.5±0.2）kg。

殼聚糖（生化試劑）、茶多酚（生化試劑） 上海笛柏化學品技術有限公司；溶菌酶（活力≥20 000 U/mg）國藥集團化學試劑有限公司；巰基含量測定試劑盒南京建成生物工程研究所；蛋白Marker 美國Thermo Scientific公司。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；UV 2000紫外分光光度計 上海精宏實驗設備有限公司；5430R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；T10 basic手持式均質機 德國IKA公司；DYY-12型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 魚肉樣品制備

新鮮草魚于4 ℃水中暫養1～2 h，致死后去頭、尾、鱗和內臟，以預冷的無菌水清洗干凈后剔除魚骨并切成魚片（5.0 cm×3.0 cm×0.2 cm）。分別用無菌水（對照組）和復合保鮮劑（10 mg/mL殼聚糖＋5 mg/mL茶多酚＋2 000 U/mL溶菌酶）浸泡10 min，瀝水3 min后用自封袋包裝，置于4 ℃ 冰箱中保藏。樣品分別于第0、3、6、9、12天取出，測定其蛋白質相關指標。

1.3.2 揮發性鹽基氮含量測定

揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》中半微量定氮法測定。

1.3.3 草魚肌肉蛋白的提取

將魚肉樣品取出后絞碎，準確稱取約10 g，加入100 mL 20 g/L的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，均質30 s后于25 ℃水浴浸提30 min，8 000 r/min離心10 min，收集上清液即為肌肉總蛋白質提取液，備用。

1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

準確吸取1.3.3節中蛋白質提取液0.2 mL于1.5 mL EP管中，加入等體積的2×上樣緩沖液（每10 mL含2.5 mL 0.5 mol/L Tris-HCl、2.0 mL甘油、4.0 mL 10 g/100 mL SDS、0.5 mL 0.1 g/100 mL溴酚藍、1.0 mL?β-巰基乙醇），沸水浴5 min，12 000 r/min離心3 min，所得上清液即為待電泳分析樣品，參考李強等[13]的方法，以質量分數12%的分離膠進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.5 高效液相體積排阻色譜分析

將1.3.3節中制備的蛋白質提取液進行真空冷凍干燥，得草魚肌肉蛋白質凍干粉。稱取蛋白質凍干粉，配制成質量濃度為5 mg/mL的蛋白液溶液，8 000 r/min離心20 min，上清液用0.45 μm的微孔過濾膜過濾，參考Liu Yongle等[14]的方法，采用高效液相體積排阻色譜（size-exclusion chromatograghy-high performance liquid chromatograghy，SEC-HPLC）法測定其分子質量分布；同時以甲狀腺球蛋白（669 kDa）、醛縮酶A（158 kDa）、牛血清白蛋白（67 kDa）、卵清白蛋白（43 kDa）、辣根過氧化物酶（40.2 kDa）、腺苷酸激酶（32 kDa） 、肌紅蛋白（17 kDa）、核糖核酸酶（13.7 kDa）、抑肽酶（6.5 kDa）和VB12（1.35 kDa）為標準品，同樣條件下進行SEC-HPLC分析，根據保留時間和分子質量繪制標準曲線，根據標準曲線（回歸方程y=-0.570 6x＋10.596）估算樣品中蛋白質峰的分子質量，將保留時間換算成分子質量的對數（lg Mw），重新繪制SEC-HPLC譜圖。

1.3.6 活性巰基含量的測定

準確稱取350 mg 1.3.5節制備的草魚肌肉蛋白質凍干粉，定容至50 mL，參考巰基含量測定試劑盒說明書測定其活性巰基含量。

1.3.7 表面疏水性的測定

稱取1.3.5節制備的草魚肌肉蛋白質凍干粉，配制成質量濃度為10 mg/mL的蛋白質溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm的微孔過濾膜過濾后備用。參考曾茂茂等[15]的方法，采用反相高效液相色譜法進行分析，以15 min之后的峰面積與總峰面積的比值作為疏水性指數，其值越大代表樣品的表面疏水性越強。

1.4 數據處理

每組實驗進行3～5 個平行，采用Excel軟件進行數據處理，數據以平均值±標準差表示，采用Origin 9.0軟件作圖；SDS-PAGE圖譜采用Gel-Pro Analyzer軟件輔助分析。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖復合保鮮對草魚肉冷藏過程中TVB-N含量的影響

圖1 草魚冷藏過程中TVB-N含量的變化Fig. 1 Change in TVB-N content of grass carp muscle proteins during cold storage

TVB-N是指肉類食品腐敗過程中蛋白質分解而產生的氨（NH3）和胺（R-CH2NH4）等堿性含氮物質的統稱，其含量越高則表明蛋白質分解越嚴重，間接地反映了魚肉品質的變化，是評價魚肉品質的重要鮮度指標[16-17]。由圖1可知，冷藏過程中魚肉中TVB-N含量呈逐漸上升趨勢，冷藏前6 d，TVB-N含量上升緩慢，且保鮮組和對照組無明顯差異。冷藏6 d后，對照組TVB-N含量急劇上升，第12天時已達到38.09 mg/l00 g，與貯藏初期相比增加了382%；保鮮組TVB-N含量上升稍緩，第12天時僅為11.82 mg/l00 g，仍在二級鮮度范圍[16]（不超過20 mg/100 g），這與李凱風等[18]研究涂膜劑對鯽魚冷藏過程中TVB-N含量變化的結果相似。TVB-N主要是在酶和微生物的作用下產生，楊勝平等[19]研究發現帶魚冷藏過程中TVB-N含量變化與菌落總數變化有很好的相關性，而復合保鮮劑中的殼聚糖、茶多酚、溶菌酶均具有良好的抑菌性[20-23]，從而能有效抑制微生物對蛋白質的分解，減緩TVB-N含量的增加。

2.2 殼聚糖復合保鮮對草魚肉冷藏過程中蛋白質SDS-PAGE圖譜的影響

圖2 冷藏過程中草魚肌肉總蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE pattern of total muscle proteins in grass carp during cold storage

如圖2所示，圖譜上第0天的泳道中清晰可辨的蛋白條帶有20～30 條，其中MHC、肌動蛋白以及3 種MLC條帶均較為明顯，與李強等[13]的研究結果一致。冷藏前6 d，各泳道蛋白條帶分布基本相似，保鮮組與對照組也未見明顯差異。冷藏超過6 d后，SDS-PAGE圖譜開始出現明顯變化，保鮮組與對照組可分辨出明顯差異：對照組MHC粗條帶信號明顯降低，伴隨著分子質量約130、55～72、18～22 kDa蛋白條帶信號的增加，說明大分子蛋白逐漸被降解成小分子蛋白質；而保鮮組蛋白條帶變化也有相同趨勢，但程度明顯較輕；對照組樣品的3 條MLC條帶基本消失，但保鮮組中這些條帶仍清晰可辨，說明保鮮延緩了其降解，這與鄭紅等[24]的研究結果相似。此外，對照組樣品在第9天新增了一條約20 kDa和一條約37 kDa的蛋白條帶（圖2中箭頭所示），但保鮮組中該20 kDa條帶在第12天才可分辨，而37 kDa條帶直到第12天仍未發現。上述結果進一步證實了冷藏過程中草魚肌肉蛋白逐步降解的事實，而殼聚糖復合保鮮能有效降低肌肉中特定蛋白質的降解速率。Delbarre-Ladrat等[25]認為魚體解僵與自溶期的蛋白質分解和內源酶的作用有關；Yu Dawei等[26]以20 mg/mL殼聚糖處理草魚片，發現冷藏組樣品的組織蛋白酶B與B＋L活力分別降至初始值的58%與65%，蛋白水解和魚片軟化程度也相應降低。因此，殼聚糖復合保鮮延緩草魚肌肉蛋白質的降解，除了其抑菌作用外，也可能與其抑制酶活力有關。

2.3 殼聚糖復合保鮮對草魚肉冷藏過程中蛋白質分子質量分布的影響

SEC-HPLC是測定聚合物結構和分子質量分布最有效的手段之一，可以通過譜圖對試樣之間分子質量分布進行直觀比較。如圖3所示，新鮮草魚肌肉蛋白質（0 d）在SEC-HPLC圖譜中有3 個主要的洗脫峰，其中峰1、峰2對應組分的分子質量分別約為5、40 kDa，峰3對應組分的分子質量大于1 000 kDa（色譜柱洗脫極限），說明一部分蛋白質分子以超大聚集體的形式存在。冷藏前6 d，保鮮組和對照組的圖譜變化均不明顯，這與SDS-PAGE分析的結果相符；冷藏第9天，對照組的峰3面積明顯變小，至第12天時幾乎完全消失，表明原有蛋白質聚集體逐漸解體，可能與冷藏過程中肌肉蛋白質的不斷氧化、降解有關；然而，保鮮組峰3的變化明顯滯后很多，冷藏第12天時峰面積占比仍為37.35%，較第0天（39.60%）僅下降了5.68%，表明殼聚糖復合保鮮延緩肌肉蛋白質變化的作用非常明顯。此外，隨著冷藏時間的延長，對照組峰1的面積比也在不斷增加，至第12天時已增加至31.95%，比第0天（18.68%）增加了71.03%，而保鮮組在12 d內幾乎無明顯變化，這進一步證實了殼聚糖復合保鮮抑制魚肉蛋白質降解的作用。

圖3 冷藏過程中草魚肌肉蛋白質分子質量分布變化Fig. 3 Molecular mass distribution of muscle proteins in grass carp at different cold storage times

2.4 殼聚糖復合保鮮對草魚肉冷藏過程中活性巰基含量的影響

圖4 冷藏過程中草魚肌肉蛋白活性巰基含量變化Fig. 4 Changes in active sulfhydryl group content in muscle proteins of grass carp during cold storage

巰基是蛋白質分子中最具反應活性的功能基團之一，其含量的變化一定程度上反映了蛋白質結構的變化[27-28]。如圖4所示，冷藏過程中草魚肌球蛋白活性巰基含量呈逐漸下降趨勢，表明草魚肌肉蛋白質總體上在不斷變化，可能是游離巰基氧化生成二硫鍵，這與Lu Han等[29]的研究結果一致。相對于對照組，保鮮組活性巰基含量的下降趨勢比較平緩，冷藏9 d兩組差異尤為明顯；冷藏第12天時，對照組活性巰基含量較第0天下降了21.39%，而保鮮組僅下降了9.89%。Ramirez等[30]報道抗氧化劑可與蛋白質結合，從而減緩蛋白質的降解和氧化；而茶多酚具有抗氧化作用，將多酚化合物與殼聚糖混合使用能有效提升殼聚糖的抗氧化活性[31]。因此，殼聚糖復合保鮮能有效減緩肌肉蛋白質的氧化等不利變化。

2.5 殼聚糖復合保鮮對草魚肉冷藏過程中表面疏水性的影響

圖5 冷藏過程中草魚肌肉蛋白表面疏水性變化Fig. 5 Changes in surface hydrophobicity of muscle proteins in grass carp during cold storage

蛋白質表面疏水性與蛋白質的功能性質密切相關，可反映蛋白質的變性程度，表面疏水性增加表明蛋白的變性程度增加[32-33]。如圖5所示，隨冷藏時間的延長，保鮮組和對照組草魚肌肉蛋白質的疏水性指數均呈現先增后降低的趨勢，表明冷藏前期表面疏水性逐漸增加，冷藏過程中蛋白質變性伸展，埋藏在蛋白質內部的疏水性基團暴露[13]；冷藏后期表面疏水性逐漸下降，可能與蛋白質的過度變性、降解、氧化重折疊和聚合等變化有關[34]。上述變化規律與Benjakul等[35]的研究結果基本一致。盡管保鮮組和對照組草魚肌肉蛋白質表面疏水性的變化趨勢一致，但保鮮組的變化幅度明顯較小，表明其蛋白質氧化、變性程度相對較小，說明殼聚糖復合保鮮能使冷藏過程中草魚肌肉蛋白質的結構和性質維持相對穩定。

3 結 論

冷藏過程中草魚肌肉蛋白質逐漸發生變性、氧化和降解等變化，但殼聚糖復合保鮮處理能明顯減緩其變化程度，在冷藏6 d后對抑制TVB-N含量升高、魚肉蛋白降解、活性巰基含量下降、表面疏水性變化等蛋白質相關指標變化的作用尤為明顯。保鮮能在一定程度上延長魚肉的貨架期，但其對草魚肌肉蛋白質變化的影響尚缺乏深入探討，本研究為殼聚糖復合保鮮劑能通過延緩冷藏過程中草魚肌肉蛋白質的結構和性質變化發揮魚肉保鮮作用提供了證據，也為今后根據蛋白質理化特征開發更有效的保鮮技術提供了理論依據。