CaCl2增強橄欖假絲酵母對蘋果果實采后青霉病的生防效力

蔡孟軒，鄧麗莉,2，姚世響,2，曾凱芳,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

果蔬采后生物防治關鍵在于拮抗微生物能夠在果皮或體內定植，通過自身的不斷繁殖從而對病原菌產生對抗作用，而酵母和病原真菌都屬于異養生物，必須從外界吸收營養物質來維持生存。經研究發現，橄欖假絲酵母（Candida oleophila）可能的抑菌機制為營養和空間的競爭，當拮抗菌數量充足時，拮抗酵母能夠搶占更多的營養物質和空間，從而抑制病原菌的生長[1-2]。現階段的研究發現，Pichia caribbica、Pichia guilliermondii、Aureobasidium pullulans等拮抗菌均可以通過營養與空間競爭的作用機制減少果蔬采后真菌病害[3-5]。當向酵母添加外源營養物時，營養物的種類、添加量都會對酵母的控制病害效果產生影響。目前有研究表明，拮抗微生物通過結合某些佐劑即營養物質（如某一種糖類、氨基酸等）可以增加其群體數量并增強其存活率，同時，病原菌對這些佐劑的利用率則較低，在兩種因素共同作用下，控病效果大大提升。除了營養和空間的競爭機制外，誘導果實自身產生抗病性也是拮抗酵母作用的機制之一[6-7]。當植物體受到生物、化學或者物理因素影響時，會刺激其自身抵抗病原菌的相關防御系統，酵母作為一種生物激發子，可以誘導植物體自身產生一系列抗性相關的物質[8-9]。拮抗酵母產生的誘導抗病性可以促進植物組織產生病程相關蛋白家族和酚類代謝系統中的一些酶如過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、幾丁質酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）的活力，以及促進木質素和酚類物質的生成等[7,10]。

近幾年的研究結果表明，CaCl2可以和多種酵母結合使用，增強拮抗酵母菌對多種果實病害的生防效力。然而，有關CaCl2和C. oleophila結合使用控制蘋果果實采后青霉病病害的相關研究卻鮮見報道。本研究先通過離體實驗考察CaCl2對C. oleophila和擴展青霉菌（Penicillium expansum）生長狀況的影響，在此基礎上進行蘋果果實活體實驗，篩選最佳的復合比例并探究最佳復合質量濃度CaCl2結合C. oleophila處理果實，增強C. oleophila對蘋果果實采后青霉病的控制效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘紅富士’蘋果產自甘肅靜寧，取大小均一、無機械傷、成熟度基本一致的果實作為實驗材料。經質量分數為2%的次氯酸鈉浸泡2 min后，自來水沖洗，晾干備用[11]。

C. oleophila分離自重慶北碚歇馬鎮馮家槽柑桔樹（‘錦橙447’）葉片表面。該菌株在NYDA培養基（酵母膏5 g、牛肉膏8 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g、水1 000 mL）中、4 ℃條件下保藏。每兩個月活化一次。

擴展青霉菌分離自發病蘋果果實。采用組織分離法從發病蘋果果實上分離病原菌，且致病性檢測結果、病原菌菌落形態、菌絲形態以及分子生物學鑒定結果表明其為擴展青霉菌。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；BS-4G振蕩培養箱 金壇市富華儀器有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；PSX-280手提式高壓殺菌鍋 上海申安醫療器械廠；XB.K.25血球計數板型 上海求精生化試劑有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；SL602N高精顯電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興有限公司。

1.3 方法

1.3.1 離體條件下CaCl2對C. oleophila和P. expansum生長狀況的影響

1.3.1.1 CaCl2在NYDB培養基中對C. oleophila生長狀況的影響

在含90 mL NYDB液體培養基的試管中分別加入10 mL不同質量濃度的CaCl2溶液，使試管中CaCl2的最終質量濃度為0、10、20、50、100 g/L。將2 mL 1×108CFU/mL的C. oleophila細胞懸浮液接種于液體培養基內，在28 ℃、200 r/min的搖床中培養24 h后計數。每個處理組重復3 次。

1.3.1.2 CaCl2在PDA培養基中對P. expansum生長狀況的影響

用移液器吸取1 μL 1×106CFU/mL的P. expansum孢子懸浮液點在含有不同質量濃度CaCl2（0、5、10、20 g/L）PDA培養基中央。25 ℃條件下培養7 d后拍照。每個處理組重復3 次。

1.3.2 CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實采后青霉病的抑制作用

1.3.2.1 CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實采后青霉病的抑制效果

將果實隨機分成6 組。用無菌打孔器在果實赤道部位等距離打孔（直徑3 mm，深度3 mm），每個蘋果打3 個傷口，每個處理組果實傷口處分別加入20 μL下述液體：1）無菌水（陽性對照）；2）1×107CFU/mL C. oleophila懸浮液；3）5 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. oleophila混合懸浮液；4）10 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. oleophila混合懸浮液；5）20 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. Oleophila混合懸浮液；6）50 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. oleophila混合懸浮液。4 h后，在果實傷口處接入20 μL的1×105CFU/mL P. expansum孢子懸浮液，待菌液吸收后，單果包裝，置于25 ℃、相對濕度90%～95%條件下貯藏，定期統計果實發病率和病斑直徑。每個處理組10 個果實，重復3 次。

1.3.2.2 CaCl2復合處理對C. oleophila在蘋果果實傷口生長動態的影響

傷口接種處理：將果實隨機分成2 組。用無菌打孔器在果實赤道部位等距離地打傷口（直徑3 mm，深度3 mm），每個蘋果打3 個傷口，每個傷口處分別加入20 μL的1×107CFU/mL C. oleophila懸浮液、10 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. oleophila混合懸浮液。待菌液吸收后，單果包裝，在25 ℃、相對濕度90%～95%環境下貯藏，以接種后1 h測定的酵母菌數為起始值，每天取一次樣，用稀釋平板法測定酵母數目。取樣時，用消毒的打孔器取傷口處直徑為1 cm的果肉組織10 份，放入含10 mL無菌水的消毒研缽內研磨至勻漿，25 ℃條件下培養48 h后計數，結果以每傷口處酵母數量為單位（lg（cells/wound）），每個處理組重復3 次，每個重復10 個果實，實驗重復3 次。

1.3.3 CaCl2與C. oleophila復合處理誘導蘋果果實抗病性機制

1.3.3.1 樣品處理及取樣方法

將果實隨機分成3 組。用無菌打孔器在果實赤道部位等距離地打傷口（直徑3 mm，深度3 mm），每個蘋果打3 個傷口，每個傷口處分別加入20 μL的無菌水（陽性對照）、1×107CFU/mL C. oleophila懸浮液、10 g/L CaCl2與1×107CFU/mL C. oleophila混合懸浮液。貯藏及取樣方法同1.3.2.2節，每個處理組重復3 次，每個重復30 個果實，實驗重復3 次。

1.3.3.2 CHI、GLU活力測定

酶提取液制備：稱取1.0 g蘋果果肉，加入4 mL 200 mmol/L pH 5.2的醋酸緩沖液，在冰浴條件下研磨勻漿，于4 ℃、8 000 r/min離心30 min，收集上清液用于CHI和GLU活力測定。

CHI活力的測定參考Boller等[12]的方法并略作修改。取0.05 mL粗酶液，加入0.5 mL 10 mg/mL膠狀幾丁質懸浮液和0.95 mL 100 mmol/L pH 5.2的醋酸緩沖液，混合后在37 ℃保溫培養1 h。然后往該混合液中加入0.1 mL、質量分數為3%的脫鹽蝸牛酶，繼續37 ℃保溫培養70 min，立即加入0.2 mL 0.6 mol/L的四硼酸鉀溶液，沸水浴3 min，然后迅速冷卻。冷卻完畢，加入2 mL用冰醋酸稀釋5 倍體積的對二甲氨基苯甲醛儲備液。再37 ℃保溫培養30 min顯色，然后測定585 nm波長處的吸光度。以煮沸5 min酶液作對照，根據標準曲線，計算N-乙酰葡萄糖胺（Glc-Nac）生成量，以每秒鐘每克蛋白分解膠狀幾丁質產生1×10-9mol Glc-NAc為一個酶活力單位（U）。實驗重復3 次。

GLU活力測定參考Abeles等[13]的方法并略作修改。取100 μL粗酶液，加入100 μL質量分數0.4%昆布多糖溶液，于37 ℃保溫反應45 min后，加入1.8 mL蒸餾水和1.5 mL DNS試劑，沸水浴加熱5 min終止酶促反應。煮沸后迅速冷卻，然后用蒸餾水將顯色的反應液稀釋至25 mL，混勻，測定540 nm波長處的吸光度。以加熱煮沸5 min的酶液作對照，根據標準曲線，計算生成還原糖的量，以每秒鐘每毫克蛋白分解昆布多糖產生1×10-9mol葡萄糖為一個酶活力單位（U）。實驗重復3 次。

1.3.3.3 木質素含量的測定

木質素含量的測定參照Li Hua等[14]的方法并略作修改。稱取1 g樣品，加5 mL、體積分數95%乙醇溶液研磨，經8 000 r/min離心10 min，沉淀物以3 mL 95%乙醇溶液沖洗3 次，再用3 mL乙醇-正己烷（1∶2，V/V）離心沖洗3 次，收集沉淀物，于65 ℃環境下干燥12 h左右。干燥物溶于3 mL、體積分數25%溴乙酰冰醋酸溶液中，在70 ℃恒溫水浴中加塞保溫30 min，然后加0.9 mL 2 mol/L NaOH溶液終止反應，再以冰醋酸定容至10 mL，8 000 r/min離心10 min，吸取上清液0.50 mL加入到9.50 mL蒸餾水中，以蒸餾水為參比調零，在280 nm波長處測定光密度。以每克鮮質量樣品在280 nm處的光密度（OD值）表示木質素含量。重復3 次。

1.3.3.4 總酚和類黃酮含量的測定

總酚和類黃酮含量測定參照Deng Lili等[15]的方法進行測定。1.0 g樣品與預冷的20 mL、體積分數1%HCl-甲醇溶液充分研磨提取，然后4 ℃、12 000×g離心10 min，上清液直接用于比色。總酚含量以每克鮮質量樣品在280 nm波長處的光密度（OD值）表示，類黃酮含量以每克鮮質量樣品在325 nm波長處的光密度（OD值）表示。實驗重復3 次。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2016軟件統計分析所有數據，計算標準差并制圖；應用SPSS 22軟件進行方差分析，利用鄧肯氏多重比較對差異顯著性進行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 離體條件下CaCl2對C. oleophila和P. expansum生長狀況的影響

2.1.1 CaCl2在NYDB培養基中對C. oleophila生長狀況的影響

CaCl2在NYDB培養基中對C. oleophila生長狀況的影響如圖1所示，在28 ℃下培養24 h后，當CaCl2質量濃度小于50 g/L時，CaCl2對C. oleophila生長有顯著促進作用（P＜0.05）；100 g/L CaCl2對C. oleophila生長有顯著抑制作用（P＜0.05）。說明不同質量濃度的CaCl2對C. oleophila的生長狀況有不同影響。

圖1 不同CaCl2質量濃度對C. oleophila生長情況的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of CaCl2 on the growth of C. oleophila

2.1.2 CaCl2在PDA培養基中對P. expansum生長狀況的影響

圖2 不同質量分數CaCl2對P. expansum生長狀況的影響Fig. 2 Inhibitory effects of different concentrations of calcium chloride on mycelial growth of P. expansum

CaCl2在PDA培養基中對P. expansum生長狀況的影響如圖2所示，在25 ℃下培養7 d后，與對照組（0 g/L）相比，5 g/L CaCl2處理對P. expansum生長有促進作用，其P. expansum產孢能力較強。與對照組相比，10、20 g/L CaCl2處理對P. expansum生長有抑制作用，其P. expansum產孢能力弱。說明不同質量濃度的CaCl2對P. expansum的生長狀況有不同影響。

2.2 CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實采后青霉病的抑制作用

2.2.1 CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實采后青霉病的抑制效果

CaCl2與C. oleophila復合使用對蘋果果實采后青霉病的抑制效果如圖3所示，在貯藏3 d和4 d時，5 個處理組果實的發病率和病斑直徑顯著低于對照果實（P＜0.05），說明這5 種處理均能有效延緩蘋果果實采后青霉病的發生。在整個貯藏期間，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組果實的發病率和病斑直徑顯著低于其他5 組（P＜0.05），說明其控制病害的效果最好。以該條件處理果實，進行復合處理誘導果實抗病性機制的研究。

圖3 CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實采后青霉病的控制效果Fig. 3 Effects of calcium chloride combined C. oleophila on disease incidence and lesion diameter in apples inoculated with P. expansum

2.2.2 CaCl2對C. oleophila在蘋果果實傷口生長動態的影響

圖4 CaCl2對C. oleophila在蘋果果實傷口生長動態的影響Fig. 4 Effect of calcium chloride on the growth dynamics of C. oleophila on apples

如圖4所示，2 個處理組C. oleophila均能在果實傷口處迅速定植、擴增，10 g/L CaCl2處理對C. oleophila在蘋果果實傷口處的生長具有促進作用，貯藏2 d時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組的C. oleophila的數量比接種時增加了1.91（lg（cells/wound））。

2.3 CaCl2與C. oleophila復合處理誘導蘋果果實抗病性機制

2.3.1 CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實CHI和GLU活力的影響

圖5 CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實CHI（A）和GLU（B）活力的影響Fig. 5 Effect of calcium chloride with C. oleophila treatment on CHI (A)and GLU (B) activities in apples

CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實CHI活力的影響如圖5A所示。在5 d的貯藏期內，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組和C. oleophila單獨處理組蘋果果實的CHI活力大致呈先上升后下降的趨勢。第2天時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實的CHI活力顯著高于C. oleophila單獨處理組和對照組（P＜0.05）。

CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實GLU活力的影響如圖5B所示，在5 d的貯藏期內，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實的GLU活力總體呈先上升后下降的趨勢，且與對照組差異顯著（P＜0.05）。貯藏第2天時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實的GLU活力約為對照組的2.2 倍。

2.3.2 CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實總酚、類黃酮和木質素含量的影響

CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實總酚含量的影響如圖6A所示。在5 d的貯藏期內，所有組蘋果果實的總酚含量總體呈先上升后下降的趨勢；C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組果實總酚含量顯著高于C. oleophila單獨處理組和對照組（P＜0.05）。貯藏第3天時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實總酚含量達到最高，約為C. oleophila處理組的1.36 倍。

CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實類黃酮含量的影響如圖6B所示。在5 d的貯藏期內，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組果實類黃酮含量顯著高于C. oleophila單獨處理組和對照組（P＜0.05）。在貯藏第2天時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實類黃酮含量達到最大，約為C. oleophila組的1.11 倍。

CaCl2與C. oleophila復合處理對蘋果果實木質素含量影響如圖6C所示。在5 d的貯藏期內，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組果實木質素含量顯著高于C. oleophila單獨處理組和對照組（P＜0.05），貯藏第2天時，C. oleophila＋10 g/L CaCl2處理組蘋果果實木質素含量達到最高。

圖6 CaCl2與C. oleophila處理對蘋果果實總酚（A）、類黃酮（B）和木質素（C）含量的影響Fig. 6 Effect of calcium chloride with C. oleophila treatment on the contents of total phenols (A), flavonoids (B) and lignins (C) in apples

3 討 論

前期研究表明，C. oleophila具備很高的商業化應用價值，但是，單一地使用拮抗酵母對果蔬采后進行生物防治的效果并不比傳統的化學殺菌劑好，故而積極探索如何提高酵母的生防效力便顯得尤為重要。目前，有多項研究將拮抗酵母復合其他物質（如金屬離子、有機物、化學殺菌劑和其他化學或天然物質）以達到增效目的[19-24]。外源物質通過提高拮抗微生物在果實表面的生長數量，不僅可以有效地對抗病原菌的侵害，還可降低拮抗菌劑的用量，是一種更為安全有效的方式，具有很好的應用前景。

相關研究表明，果蔬在采后經過一定的物理或化學因子處理后，可產生誘導抗性，從而減少其采后病害的發生率[25-28]。CaCl2是果蔬采后處理的傳統方法之一，能夠對果蔬采后貯藏期有明顯的延長作用[29-31]。本研究發現，C. oleophila與10 g/L CaCl2復合處理對蘋果果實采后青霉病的發生抑制效果最好，10 g/L CaCl2對C. oleophila控制蘋果果實采后青霉病的發生具有增效作用。

為進一步探討CaCl2與C. oleophila復合處理對P. expansum的抑制機理，本實驗測定了C. oleophila與10 g/L CaCl2復合處理對蘋果相關防御酶及物質的影響。結果表明，該復合處理能有效誘導蘋果相關抗性酶活力的提高。本實驗選取與果蔬采后病程相關的酶及代謝產物，探究其與果蔬采后病害防治關系。病程相關蛋白家族和酚類代謝系統中的一些酶與植物體內抵抗病原微生物的侵染都有著一定的關系。酚類物質具有直接的抗菌作用[32]，病原真菌的細胞壁主要成分為幾丁質和葡聚糖，CHI和GLU均可通過水解病原菌細胞壁中幾丁質和葡聚糖，使得病原菌原生質膜破裂從而殺死病原菌[33]。CHI和GLU在降解病原菌細胞壁時會產生協同作用，從而使抑菌活性達到最大[34]。本研究結果表明，C. oleophila與10 g/L CaCl2復合處理能顯著提高蘋果的CHI、GLU活力和總酚、木質素、類黃酮含量。因此，該復合處理可以通過提高防御酶活性、抗病相關蛋白活性，增加抗病物質的含量，從而誘導蘋果果實采后抗病性的產生。