蛋氨酸特異性合成途徑關鍵酶
——高絲氨酸O-酰基轉移酶的研究進展

劉詩夢，韓彩靜，高云娜，趙 蘭，盧紅妍，閔偉紅*

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

高絲氨酸O-酰基轉移酶屬于α/β水解酶超家族，通過催化底物高絲氨酸發生酰基化得到產物酰基高絲氨酸，激活蛋氨酸特異性合成途徑，是蛋氨酸合成過程中的關鍵酶。該酶不但與高絲氨酸激酶共同競爭底物高絲氨酸，決定高絲氨酸在蛋氨酸合成途徑的利用率，而且直接硫化和轉硫途徑都需經過該酶催化才能進行，可見高絲氨酸O-酰基轉移酶在蛋氨酸合成途徑中十分重要。

蛋氨酸作為人和動物體內唯一含硫必需氨基酸，在食品、醫藥及飼料行業中應用廣泛。目前用于生產蛋氨酸的化學合成法[1]存在環境污染、產物為DL型混合物分離困難等問題，迫使學者和生產企業急需尋找環境友好的微生物發酵法[2]替代化學合成法。已有多位學者對微生物體內蛋氨酸的合成代謝網絡進行研究[3-5]，均取得一定成果，為提高蛋氨酸產量積累了經驗。但由于蛋氨酸合成途徑代謝調控復雜，現有的改造策略僅能在實驗室水平小幅度提高蛋氨酸產量，不能達到工業生產要求；因此，如何構建高產蛋氨酸工程菌成為發酵法產蛋氨酸亟待解決的難題和瓶頸，引起了各國學者的廣泛關注[6-8]。

蛋氨酸的合成途徑在大腸桿菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中已被闡明[9]（圖1）。作為蛋氨酸特異性合成途徑的第一個酶，高絲氨酸O-酰基轉移酶對高絲氨酸的米氏常數Km為2.8 mmol/L[10]，與底物高絲氨酸的結合能力較弱，酶活力和酶量受終產物（甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸）[11]的反饋抑制和阻遏，且極不耐熱，在30 ℃下半衰期大約只有40 min[12]，超過32 ℃后極易失活[12-14]。致使高絲氨酸主要被蘇氨酸合成途徑消耗，較少作為蛋氨酸合成的中間代謝物。在解除了蛋氨酸合成途徑兩個限速酶（天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶）的反饋抑制后[15-16]，位于二者之后的高絲氨酸O-酰基轉移酶作為下一個影響蛋氨酸積累的關鍵因素，決定了碳通量用于合成蛋氨酸的程度。因此，解除高絲氨酸O-酰基轉移酶受到的調控，提高酶對底物親和力和高溫下的熱穩定性，對于蛋氨酸的合成至關重要。

圖1 細菌中蛋氨酸合成途徑[9]Fig. 1 Biosynthesis pathway of methionine in bacteria[9]

由此，本文對高絲氨酸O-酰基轉移酶的結構、反應機理和現有的分子改造策略進行總結，并探討了通過改造該酶獲得穩定性強且催化效率高的突變體來提高蛋氨酸產量的可能性。

1 高絲氨酸O-酰基轉移酶在蛋氨酸合成途徑中的作用

高絲氨酸O-酰基轉移酶將乙酰-輔酶A（coenzyme A，CoA）或琥珀酰-CoA的酰基轉移到高絲氨酸的羥基氧上，使高絲氨酸酰基化，為下一步硫化做準備。該酶存在底物特異性，根據酰基供體不同，可分為高絲氨酸乙酰基轉移酶（homoserine acyltransferase，HTA）和高絲氨酸琥珀酰基轉移酶（homoserine succinyltransferase，HTS）。多數真菌及少數細菌（如C. glutamicum）使用HTA進行催化，大多數細菌（如E. coli）則使用HTS進行催化。二者之間無序列相似性，但都遵循乒乓反應的酶化學機理[17]，催化相似的酰基化反應。

HTA以乙酰-CoA為酰基供體，乙酰基首先轉移到此酶催化三聯體[18]的親核殘基上，再轉移到高絲氨酸的γ-羥基，生產乙酰高絲氨酸（圖2）。

圖2 HTA催化過程Fig. 2 Catalytic process of homoserine acetyltransferase

HTS以琥珀酰-CoA為酰基供體，將琥珀酰-CoA的琥珀酰基基團首先轉移到親核殘基，隨后轉移到高絲氨酸形成產物琥珀酰高絲氨酸（圖3）。

圖3 HTS催化過程Fig. 3 Catalytic process of homoserine succinyltransferase

2 高絲氨酸O-酰基轉移酶的結構及催化機理

部分高絲氨酸O-酰基轉移酶的晶體結構[19-21]已公布在蛋白質數據庫（Protein Data Bank，PDB）上（圖4），從蛋白折疊類型上看，該酶屬于α/β水解酶超家族，特點是核心由圍繞著α-螺旋的平行β-折疊片層組成，活性位點由高度保守的“催化三聯體”殘基組成。催化三聯體包括酸性、堿性和親核殘基，3 個殘基同時作用攻擊底物形成不穩定的共價中間復合物，降低反應活化能從而提高反應效率。

圖4 鉤端螺旋體中HTA結構（A）[19]和金黃色葡萄球菌中HTA結構（B）[21]Fig. 4 Structure of homoserine acetyltransferase in Leptospira interrogans (A)[19] and structure of homoserine acetyltransferase in Staphylococcus aureus (B)[21]

Wang Mingzhu等[19]研究了鉤端螺旋體（Leptospira interrogans）中的HTA（PDB∶2PL5）的結構，由10 個α-螺旋和10 個β-折疊組成，分為兩個獨立的結構域，包括1 個含有催化三聯體的核心α/β結構域和1 個由5 個α-螺旋組成的Lid結構域（圖5）。其催化三聯體由S153（親核殘基絲氨酸）、D311（酸性殘基天冬氨酸）和H344（堿性殘基組氨酸）組成（圖6）。H344奪取S153的1 個氫原子，激活S153的親核試劑活性，使其進攻乙酰-CoA的羰基碳，形成四面體過渡態。同時H344構象發生變化，使底物高絲氨酸進入，四面體過渡態解離，產生乙酰-HTA中間產物并釋放CoA，去質子化的高絲氨酸作為親核試劑進攻乙酰-HTA，再次形成四面體過渡態，隨后H344構象變化，釋放產物酰基高絲氨酸。

圖5 高絲氨酸乙酰轉移酶二級結構[19]Fig. 5 Secondary structure of homoserine transacetylase[19]

圖6 Leptospira interrogans中HTA催化三聯體位置（A）和HTA催化三聯體（B）[19]Fig. 6 Position of the catalytic triad of homoserine acetyltransferase (A)and the catalytic triplet of homoserine acetyltransferase (B) in Leptospira interrogans[19]

E. coli中HTS的編碼基因為metA，Rosen等[22]通過質譜鑒定其活性位點，發現琥珀酰基與D47共價結合，推測D47是催化反應的親核殘基。但Coe等[23]通過定點突變得出不同結論，認為HTS的催化三聯體由親核殘基半胱氨酸（C142）、堿性殘基組氨酸（H235）和酸性殘基谷氨酸（E237）組成，D47作為穩定琥珀酰基的關鍵殘基存在。2008年，周奕含等[24]利用同源模建的方法，以蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）HTS為模板，建立了E. coli中HTS三維結構，通過分子對接從結構上佐證了C142為親核進攻的殘基，并根據氫鍵及分子間非鍵作用推斷出穩定琥珀酰-CoA和影響催化效率的14 個氨基酸殘基。

對高絲氨酸O-酰基轉移酶的分子改造，需要建立在了解其結構和催化機制的基礎上，選擇底物高絲氨酸的結合位點和催化三聯體所處活性口袋附近的氨基酸殘基進行突變，達到降低高絲氨酸Km、提高酶對底物親和力的目的，最終提高酶的催化效率。

3 高絲氨酸O-酰基轉移酶的分子改造策略

針對高絲氨酸O-酰基轉移酶受到的末端產物反饋抑制和高溫下易聚集失活的性質，研究人員通過隨機誘變或定點突變技術來解除該酶所受的反饋抑制和提高其熱穩定性；或敲除阻遏蛋白來解除反饋阻遏，提高其在蛋氨酸合成通路中的酶活性（表1）。

表1 高絲氨酸O-酰基轉移酶分子改造策略Table 1 Molecular modification strategies for homoserine O-acyltransferase

3.1 解除反饋調控的分子改造策略

反饋阻遏是微生物合成蛋氨酸過程中經濟的調控方式，通過調節代謝途徑中酶的合成阻止代謝產物過量積累。解除高絲氨酸O-酰基轉移酶受到的反饋阻遏主要通過敲除阻遏蛋白實現。在E. coli中，阻遏蛋白MetJ涉及蛋氨酸合成及轉運基因的轉錄水平調節，以二聚體形式結合到被稱為“met-box”的回文保守序列上[31]，這段序列長8 bp，存在于蛋氨酸特異性合成途徑和吸收系統中基因的啟動子區域[32]（圖7）。S-腺苷蛋氨酸是MetJ的輔阻遏物，與MetJ結合后可提高該阻遏蛋白對“met-box”的親和力。谷氨酸棒桿菌中的McbR是TetR型阻遏蛋白[33]，由mcbR基因編碼，抑制蛋氨酸合成和硫代謝途徑中大部分基因的表達。2015年，Qin Tianyu等[4]敲除C. glutamicum的阻遏蛋白McbR后，HTA的編碼基因metX的轉錄水平上調。同樣，Han Guoqiang等[34]在C. glutamicum中敲除McbR，解除了HTA及幾乎所有蛋氨酸特異性合成途徑中的酶受到的反饋阻遏。但李瑩[5]在經誘變的C. glutamicum中敲除McbR后，發現蛋氨酸合成途徑中的8 個酶轉錄水平無明顯變化，且蛋氨酸產量下降。由于McbR作為全局調控因子，不只是對蛋氨酸合成有調控作用，還參與硫代謝的調控，敲除后會引起胞內氧化應激反應，強烈改變還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的代謝，在蛋氨酸合成途徑中降低NADPH利用率，并影響細胞生長[35]。僅通過敲除阻遏蛋白雖然能夠提高高絲氨酸O-酰基轉移酶的轉錄水平，但從菌體生長上看，這種方法會導致細胞代謝失衡，存在一定隱患。如何解決阻遏蛋白敲除后引起的代謝紊亂問題，可以作為解除高絲氨酸O-酰基轉移酶的反饋阻遏的一個研究方向。

圖7 MetJ與蛋氨酸合成途徑及吸收途徑基因結合位點[32]Fig. 7 MetJ binding sites for the methionine synthesis pathway and the uptake pathway[32]

反饋抑制是蛋氨酸合成過程中基本且快速的調節方式，避免代謝物過量積累影響代謝平衡。E. coli是工業生產的模式菌株，E. coli中HTS受蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）的協調反饋抑制，1 mmol/L蛋氨酸或1 mmol/L S-腺苷蛋氨酸濃度條件下，HTS活力僅為4%或13%[28]。2005年，Usuda等[28]將E. coli W3110中HTS的R27、I296和P298分別替換為Cys、Ser和Leu，部分解除了蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸的反饋抑制作用，在濃度為100 mmol/L的蛋氨酸或1 mmol/L的S-腺苷蛋氨酸條件下相對酶活力可保持在80%以上，雖然減弱了HTS受到的反饋抑制，但突變后酶活力比野生型HTS更低，仍需進一步研究在保證酶活力的基礎上解除反饋抑制（表2）。即便HTS突變后酶活力降低，Usuda等[28]的研究仍為隨后改造蛋氨酸合成途徑的研究提供參考，Liu Qian等[25]在E. coli中過量表達該解除反饋抑制的HTS（R27C、I296S、P298L）并敲除MetJ和過表達運輸蛋白YjeH，使蛋氨酸產量達到1.7 g/L。2015年，段昭煒[36]經定點突變后篩選出抗反饋抑制的突變體（Y299C），在1 mmol/L蛋氨酸或1 mmol/L S-腺苷蛋氨酸存在的情況下酶活力分別為86.3%及79.6%。此后關于該酶反饋抑制解除的研究鮮有報道，但可以看出HTS所受的反饋抑制沒有完全解除。相比于解除反饋阻遏來提高酶表達量，通過解除反饋抑制提高酶活力的方法更省時，能耗更少，能更加有效地催化高絲氨酸。因此仍需更進一步對酶的抑制劑結合位點進行研究，提高該酶在抑制劑存在情況下的活力。

表2 抑制劑對HTS突變體的影響[28]Table 2 Effects of inhibitors on HTS mutants[28]

3.2 提高熱穩定性的分子改造策略

Ron[37]和Gur[38]等于1971年開始研究HTS與E. coli生長速率之間的關系，其認為高溫下HTS活力降低導致E. coli生長緩慢。但關于如何提高高絲氨酸O-酰基轉移酶熱穩定性的研究較少，Mordukhova等[39]在2008年使用對metA隨機誘變來改善高溫下的E. coli生長情況，確定了I229T和N267D的突變使得E. coli菌株能夠在更高溫度下生長并增加菌株耐受酸性條件的能力。在此基礎上，Mordukhova等[40]于2013年首先通過多重序列比對的方法鑒定出E. coli中HTS不同于嗜熱HTS的8 個氨基酸位點，并分別突變得到突變體Q96K、L110V、I124L、R160L、A195T、A200E、D218G和F247Y，經驗證Q96K、I124L、F247Y 3 個突變體能夠改善升溫時E. coli的生長。隨后使用I-Mutant 2.0建模工具進行蛋白質穩定性預測，推測并證實I229Y突變可以提高HTS的穩定性，并提高E. coli在44 ℃下的生長速率。最后同時對HTS進行雙突變及三重突變，構建了攜帶雙突變（I124L-I229Y）和三重突變（I124L-I229Y-N267D）的E. coli突變株，發現二者生長速度均快于單突變株。

高絲氨酸O-酰基轉移酶高溫下易失活限制了其合成蛋氨酸的作用，為了解決這一問題，需要對該酶進行分子改造提高熱穩定性。使用生物信息學方法借助蛋白質數據庫并通過計算機模擬等手段分析酶的結構-功能關系，識別并篩選該酶穩定性差的關鍵位點，分析理化性質后應用分子生物學技術如定點突變[41]，在適當位置引入二硫鍵[42]或糖基化位點[43-44]以及截去酶結構中柔性較大的氨基酸序列[45]來提高該酶熱穩定性。以上策略在其他熱不穩定性酶中已獲得較成功的嘗試。劉曉萌等[46]應用B-FITTER軟件分析了細胞色素單加氧酶晶體結構中的溫度因子（B-factor），識別出一個不利于酶熱穩定性的關鍵殘基位點G46，對該位點進行定點飽和突變，篩選獲得一個突變體的半失活溫度比野生型高5 ℃，半衰期延長一倍。Yin Xin等[47]通過MODIP和DbD兩種計算工具預測蛋白質中可能的二硫鍵，經分子動力學模擬確定了A型阿魏酸酯酶的兩個氨基酸位點A126-N152，將其突變為半胱氨酸引入二硫鍵后最適溫度提高6 ℃，在55 ℃和60 ℃下的半衰期分別為188 min和40 min，熱穩定性提高10 倍且催化效率與野生型相近（圖8）。王小艷等[48]在β-葡萄糖醛酸苷酶模擬結構分析的基礎上，半理性方法設計并通過定點突變引入N-糖基化位點得到3 株突變菌，其中兩株熱穩定性得到改善，相比野生型分別提高13%和11%。

圖8 A型阿魏酸酯酶126和152位點突變前后示意圖[47]Fig. 8 Schematic diagram of type A feruloyl esterase before and after 126 and 152 mutations[47]

在實際生產中，發酵溫度是需要考慮的重點因素。伴隨著發酵產熱，發酵液溫度上升，高絲氨酸O-酰基轉移酶失活會影響蛋氨酸合成中碳流的利用，導致高絲氨酸積累，對細胞產生毒性或高絲氨酸被蘇氨酸合成途徑消耗，不能用于合成蛋氨酸。因此，增強高絲氨酸O-酰基轉移酶熱穩定性是改造該酶的重要方向。

4 結 語

蛋氨酸合成途徑涉及多個酶的共同作用，僅改變途徑中單個酶無法達到理想產量，但酶作為調節細胞代謝的基本元件需要擁有良好的酶學性質。針對高絲氨酸O-酰基轉移酶熱穩定性差的性質，結合生物信息學分析方法，采用突變或敲除該酶熱穩定性差的殘基或結構，獲得熱穩定性高的酶分子。在此基礎上，通過突變該酶的抑制劑結合位點和底物結合位點以解除反饋抑制，提高酶對底物的敏感性，從而提高酶的催化效率，進一步調節該酶的酶活力和酶量，可以作為研究改造高絲氨酸O-酰基轉移酶的嘗試方向。

此外，國內外多個實驗室建立了可用于E. coli和C. glutamicum的CRISPR/Cas基因組編輯系統，實現了在微生物染色體上進行基因的敲除、敲入和突變[49-53]。應用CRISPR/Cas技術直接對微生物基因組上的高絲氨酸O-酰基轉移酶進行堿基的替換及部分結構截除，或將改造后的酶敲入至經多點修飾且優化代謝網絡的微生物染色體中，可以避免外源質粒的添加，防止外源質粒丟失引起菌種性能退化的同時又減少菌體代謝負擔，對構建用于大規模發酵的高產蛋氨酸工程菌具有重要價值。