免疫細胞及腫瘤標志物與高危型HPV感染宮頸癌患者HPV水平的相關性及與預后的關系

武麗蕊，王蘭朋，李紅霞，孫巖

河北中石油中心醫院1婦科，3實驗室，河北廊坊065000

2廊坊市人民醫院胸外科，河北廊坊0650000

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發病率不斷升高且呈年輕化趨勢[1]。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一種DNA病毒，其傳播方式主要是性接觸。通常低危型HPV可能引起生殖器尖銳濕疣，而高危型HPV可能引起宮頸癌[2]。宮頸癌的發生不僅與患者伴有HPV感染有關，而且與患者的機體狀態有關，如患者的免疫力、體內微環境等。CD4+、CD8+細胞與機體T細胞的表達有關，CD56+細胞與機體自然殺傷（natural killer，NK）細胞的表達有關，這兩類細胞都是免疫細胞，當其水平降低時，機體免疫功能下降，不能清除體內的HPV，長期的HPV感染會引起宮頸癌。調節性T細胞（regulatory T cell，Treg），對機體的免疫功能具有一定的抑制作用，研究報道，這種抑制作用會使基因突變的細胞逃逸免疫監控，導致腫瘤的發生[3-5]。K-ras、Ki-67的陽性表達與細胞的增殖、遷移及血管形成有關[6-7]。HPV感染時間延長，會引起宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），這一階段的病變是可以逆轉的，若感染持續存在，則最后可能發展為宮頸癌，這個過程需要約10年的時間。因此，在宮頸病變早期對容易引起患者免疫力下降的指標及與細胞增殖有關的標志物K-ras、Ki-67進行檢測可能有助于宮頸癌的早期預防和診斷。本研究對不同宮頸疾病患者進行免疫細胞和腫瘤標志物檢測，發現免疫細胞和腫瘤標志物對宮頸癌患者的早期預防及診斷具有一定的臨床意義，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年2月至2017年10月于河北中石油中心醫院診治的有HPV感染的72例宮頸癌患者、83例CIN患者和50例慢性宮頸炎患者。納入標準：①根據臨床表現和/或活組織檢查等病理檢查結果，確定組織性質及臨床分期、分級[8-9]；②根據熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測結果確定均伴有高危型HPV感染。排除標準：①有免疫系統疾病；②妊娠、哺乳期婦女；③溝通障礙；④近3個月內有免疫治療、放化療或其他藥物治療史。納入的72例宮頸癌患者（宮頸癌組），年齡為26～64歲，平均年齡為（42.6±5.7）歲；臨床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期28例，Ⅲ期20例，Ⅳ期12例；有淋巴結轉移28例，無淋巴結轉移44例。納入的83例CIN患者（CIN組），年齡為25～66歲，平均年齡為（41.5±4.9）歲；CINⅠ級23例，CINⅡ級27例，CINⅢ級33例。納入的50例慢性宮頸炎患者（慢性宮頸炎組），年齡為23～64歲，平均年齡為（40.8±5.2）歲。3組患者的平均年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，且所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器

藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的小鼠抗人CD4、CD8、CD56抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的Treg、K-ras、Ki-67抗體均購自美國BD Bioscience公司；臺盼藍染色液、紅細胞裂解液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）均購自上海遠慕生物科技有限公司。其中，CD4+、CD8+用于標記免疫細胞中的T細胞，CD56+用于標記免疫細胞中的NK細胞。K-ras、Ki-67可代表細胞的增殖、擴散等能力。采用美國BD Biosciences Accuri C6流式細胞檢測儀進行流式細胞術（flow cytometry，FCM）檢測，HPVDNA分型檢測儀器購自深圳市科潤達生物工程有限公司。

1.3 觀察指標和檢測方法

所有患者均于入院后第1天抽取空腹靜脈血3 ml。使用FCM檢測患者外周血中CD4+、CD8+、CD56+、Treg的水平，使用免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）檢測患者病變組織中腫瘤標志物（K-ras、Ki-67）的表達情況；對比分析3組患者 CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD56+、Treg的水平及K-ras、Ki-67的陽性表達情況。FCM檢測步驟：取各組患者外周血后，加入抗凝劑保存于4℃冰箱內，于1 h內進行檢測；將淋巴細胞濃度調整為約5×106/L，使用臺盼藍染色，確定活細胞率>85%，保證測試的準確性；將100 μl全血加入測定管中，加入 PBS 稀釋至 200 μl，加入 20 μl FCM 專用抗體并混勻；在4℃冰箱內避光孵育30 min；加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，直至液體澄清；使用PBS清洗3次后，加入0.1%的甲醛溶液將細胞固定，在2 h內上機檢測。IHC檢測步驟：分別取3組患者的病變組織，4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，組織切片；脫蠟水化后，抗原修復；封閉內源性過氧化酶后，充分清洗；4℃孵育一抗過夜；室溫放置1 h后，清洗掉一抗，孵育二抗；二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色后，復染；鏡下觀察。K-ras和Ki-67的陽性表達率計算方法：選取視野中1000個細胞，觀察陽性細胞比例，0～5%為（-），6%～25%代表（+），26%～75%代表（++），76%～100%代表（+++）。

1.4 隨訪

所有患者均隨訪1年，隨訪方式為電話隨訪結合上門隨訪。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件分析數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者外周血免疫細胞水平的比較

宮頸癌組患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均低于CIN組患者和慢性宮頸炎組患者，但CD8+、Treg水平均高于CIN組患者和慢性宮頸炎組患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）；CIN組患者的CD4+/CD8+水平低于慢性宮頸炎組患者，Treg水平高于慢性宮頸炎組患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 3組患者外周血免疫細胞水平的比較（±s）

表1 3組患者外周血免疫細胞水平的比較（±s）

注：a與慢性宮頸炎組比較，P<0.05；b與CIN組比較，P<0.05

指標CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+CD56+（%）Treg（%）慢性宮頸炎組（n=50）36.54±7.23 23.64±5.13 1.55±0.47 16.32±5.17 4.37±1.21 CIN組（n=83）34.68±6.54 24.92±5.46 1.39±0.43a 15.51±4.79 5.32±1.43a宮頸癌組（n=72）26.62±5.46a b 30.46±6.37a b 0.87±0.36a b 11.36±3.87a b 6.14±1.62a b

2.2 3組患者腫瘤標志物陽性表達情況的比較

慢性宮頸炎組、CIN組、宮頸癌組患者的K-ras的陽性率分別為 80.0%（40/50）、77.1%（64/83）、100%（72/72），Ki-67的陽性率分別為12.0%（6/50）、83.1%（69/83）、100%（72/72）；3組患者的K-ras、Ki-67的陽性率比較，差異均有統計學意義（χ2=18.501、121.608，P＜0.05），其中宮頸癌組患者的K-ras、Ki-67陽性率最高。（表2）

2.3 宮頸癌組患者HPV水平與免疫細胞水平及腫瘤標志物陽性表達情況的相關性分析

宮頸癌組患者外周血中Treg、CD8+水平和K-ras、Ki-67陽性表達情況與HPV-DNA水平呈正相關（r=0.546、0.402、0.645、0.713，P＜0.05），而CD4+、CD56+水平與HPV-DNA水平呈負相關（r=-0.478、-0.463，P＜0.05）。

表2 3組患者的腫瘤標志物陽性表達情況[ n（%）]*

2.4 宮頸癌組有無淋巴結轉移患者的免疫細胞水平及腫瘤標志物陽性表達情況的比較

宮頸癌組有淋巴結轉移患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均明顯低于無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（χ2=6.767、3.389、5.538，P＜0.01）；但CD8+、Treg水平均明顯高于無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（χ2=9.864、9.607，P＜0.01）（表3）。宮頸癌組有淋巴結轉移的患者K-ras（+++）、Ki-67（+++）的比例分別為46.4%（13/28）、50.0%（14/28），均高于無淋巴結轉移的18.2%（8/44）、25.0%（11/44），差異均有統計學意義（χ2=6.608、4.718，P＜0.05）。

表3 宮頸癌組有無淋巴結轉移患者的免疫細胞水平（±s）

表3 宮頸癌組有無淋巴結轉移患者的免疫細胞水平（±s）

指標CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+CD56+（%）Treg（%）有淋巴結轉移（n=28）21.06±5.47 39.02±5.97 0.62±0.28 10.03±3.08 8.04±1.48無淋巴結轉移（n=44）30.12±5.58 24.93±5.87 1.02±0.31 12.21±2.36 4.92±1.25

2.5 宮頸癌組死亡患者與生存患者免疫細胞水平及腫瘤標志物陽性表達情況的比較

隨訪1年，72例宮頸癌患者中，23例患者死亡，49例患者生存。宮頸癌組死亡患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均明顯低于生存患者，差異均有統計學意義（t=7.824、8.342、5.704，P＜0.01）；但CD8+、Treg水平均明顯高于生存患者，差異均有統計學意義（t=4.023、8.229，P＜0.01）（表4）。宮頸癌組死亡患者的 K-ras（+++）、Ki-67（+++）的比例分別為52.2%（12/23）、65.2%（15/23），明顯高于生存患者的18.4%（9/49）、20.4%（10/49），差異均有統計學意義（χ2=8.659、13.866，P＜0.01）。

表4 宮頸癌組死亡患者和生存患者免疫細胞水平（±s）

表4 宮頸癌組死亡患者和生存患者免疫細胞水平（±s）

指標CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+CD56+（%）Treg（%）死亡患者（n=23）18.15±5.27 34.15±5.26 0.57±0.27 7.66±2.73 7.95±1.36生存患者（n=49）30.61±6.72 28.76±5.32 1.01±0.32 13.06±2.48 5.29±1.24

3 討論

免疫系統在腫瘤的發生過程中具有重要的作用，其中，輔助性T淋巴細胞如CD4+細胞等分泌的細胞因子可以提高患者的免疫力，從而殺傷腫瘤細胞，而抑制性T細胞如CD8+細胞等在免疫系統殺傷腫瘤細胞的過程中起負調控的作用，這兩類T細胞相互協調、相互制約，共同調節機體的免疫應答[10-11]。CD56+細胞主要存在于血液、脾臟及骨髓等部位，是NK細胞的標志物，在沒有抗體和致敏淋巴細胞的作用下，其可以迅速由腫瘤細胞激活，并對腫瘤細胞進行抑制和殺傷。Treg細胞在腫瘤的發生過程中對免疫系統起抑制作用，有助于血液系統中的腫瘤細胞逃脫免疫系統的監控而不被殺死，導致人體腫瘤細胞的積聚[3,11]。K-ras屬于RAS家族成員之一，能夠編碼K-ras蛋白，在正常人體環境中，其能夠調控細胞的生長，而在異常人體環境中，其能夠促進細胞持續生長，甚至發生基因突變，導致該基因永久活化，進一步引起細胞內信號不能正常轉導，細胞持續增殖，發生癌變。Ki-67是細胞增殖的一種標志物，除細胞靜止期外，其在細胞分裂的各個時期均有表達，其陽性表達率越高，提示腫瘤細胞增殖越活躍，與腫瘤的發生、轉移等有關[12]。文獻報道，宮頸癌的發生不僅與患者自身感染高危型HPV有關，而且與患者的免疫功能有關[13-14]，同時檢測腫瘤標志物的變化有助于腫瘤的早期發現。

本研究結果顯示，宮頸癌組患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均低于CIN組患者和慢性宮頸炎組患者（P＜0.05），說明宮頸癌患者的免疫功能下降，很可能是由于其免疫功能長期處于較低水平，HPV長期感染，導致宮頸癌的發生；宮頸癌組患者的CD8+、Treg水平均高于CIN組患者和慢性宮頸炎組患者（P＜0.05），說明宮頸癌患者的免疫功能被抑制，很可能是因為腫瘤細胞逃逸，導致腫瘤細胞累積，疾病逐漸惡化。3組患者的K-ras、Ki-67的陽性率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中宮頸癌組患者的K-ras、Ki-67陽性率最高，說明宮頸癌細胞增殖活躍能力及細胞遷移能力強于其他兩組。隨著疾病進展，患者體內相應的抑制性T細胞水平與K-ras、Ki-67陽性表達情況均有升高趨勢；而輔助性T細胞水平卻降低。本研究結果顯示，宮頸癌組患者外周血中Treg、CD8+水平和K-ras、Ki-67陽性表達情況與HPV-DNA水平呈正相關；CD4+、CD56+水平與HPV-DNA水平呈負相關。同時，宮頸癌組有淋巴結轉移患者的CD4+、CD56+、CD4+/CD8+水平均明顯低于無轉移的患者（P＜0.01），CD8+、Treg水平和 K-ras（+++）、Ki-67（+++）的比例均高于無淋巴結轉移的患者（P＜0.05）；宮頸癌組死亡患者的上述輔助性T淋巴細胞水平均明顯低于生存患者（P＜0.01），上述抑制性T細胞水平和腫瘤標志物陽性比例均高于生存患者（P＜0.01），進一步證明了隨著疾病的進展，患者的免疫力下降，促進了腫瘤細胞的增殖和轉移，除免疫功能指標外，K-ras和Ki-67亦可作為腫瘤檢測的輔助指標。聯合檢測患者免疫細胞與腫瘤標志物，不僅對宮頸癌的早期診斷具有重要的意義，而且在腫瘤的發生發展機制中亦具有一定的意義，為宮頸癌的早期預防、診斷及治療提供了一定的參考。由于時間和技術的限制，本研究在腫瘤的發病機制方面等未進行深入研究，有待于進一步完善。

綜上所述，免疫力降低和免疫逃逸在高危型HPV感染患者演變為宮頸癌的過程中發揮了重要的作用，檢測免疫細胞和腫瘤標志物，有助于高危型HPV感染宮頸癌患者的早期預防、診斷及預后評估。