獨活對巨噬細胞遷移抑制因子抑制作用的有效成分虛擬篩選研究

李江 夏鵬 曹必偉 徐建果

摘要：目的 ?篩選獨活對巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）抑制作用的有效成分，為獨活治療炎癥和免疫介導疾病的作用機制研究及MIF抑制劑研發提供參考。方法 ?以中國臺灣中醫藥資料庫中獨活有效成分小分子化合物為對接配體庫、MIF晶體結構為對接受體進行分子對接，篩選結合能高于原配體的小分子。對結合后的復合物構像進行相互作用分析，選取最佳配體小分子與大分子復合物進行10 ns的動力學模擬，分析均方根偏差（RMSD）值。操作平臺為Linux系統，采用OpenBabelGUI2.4.1進行小分子修飾，Pyrx0.8進行虛擬篩選，NAMD2.13進行分子動力學模擬，VMD1.9.3、Discovery studio4.5及Ligplot+1.4.5進行對接結果及動力學模擬結果分析。結果 ?篩選出優于原配體的獨活有效成分4種，分子相互作用分析提示主要作用殘基8個，主要作用力為氫鍵及疏水作用，動力學模擬結果表明最佳配體小分子與受體結合較穩定。結論 ?本研究提示獨活抗炎作用機理可能與抑制MIF活性有關，其抑制作用有效成分主要有4種，可為研究和設計MIF抑制劑提供參考。

關鍵詞：巨噬細胞遷移抑制因子;獨活;抑制劑;虛擬篩選;分子動力學模擬

中圖分類號：R2-05;R285 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0105-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.022 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To screen the active components of Angelicae Pubescentis Radix for inhibiting MIF; To provide references for the study on the mechanism of inflammatory and immune-mediated diseases and the development of MIF inhibitors. Methods Using the small molecule compound of the active components in the TCM database of Taiwan as a docking ligand library， the MIF crystal structure was the acceptor for molecular docking， and small molecules with higher binding energy than the original ligand were screened. The interaction analysis of the combined complex conformation was carried out， and the optimal ligand small molecule and macromolecular complex were selected for 10 ns kinetic simulation to analyze the root mean square deviation （RMSD） value. The operating platform was Linux system. OpenBabelGUI2.4.1 was used for small molecule modification， Pyrx0.8 for virtual screening， NAMD2.13 for molecular dynamics simulation， VMD1.9.3， Discovery studio4.5 and Ligplot+1.4.5 for docking results and dynamics simulation results analysis. Results Four active components were screened out， which were superior to the original ligand. Molecular interaction analysis indicated that there were 8 main action residues， and main force was hydrogen bonding and hydrophobic interaction. Kinetic simulation results showed that the binding of small molecules of the best ligand to the receptor was stable. Conclusion It is indicated that the anti-inflammatory mechanism of Angelicae Pubescentis Radix may be related to the inhibition of MIF activity. There are four main active components of Angelicae Pubescentis Radix， which can provide references for the study and design of MIF inhibitors.

Keywords： MIF; Angelicae Pubescentis Radix; inhibitors; virtual screening; molecular dynamics simulation

巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一類多效性的前炎癥因子，能激活轉錄因子，促進其他各類前炎癥因子的表達，同時，能直接刺激固有細胞內前炎癥因子庫的釋放，引發炎癥反應，并創造以前炎癥因子為主的炎性微環境[1]。MIF與許多炎癥和免疫介導的疾病有關，如全身性血管炎、系統性紅斑狼瘡和類風濕關節炎（RA）等。臨床研究表明，MIF與RA發病密切相關，其抑制結合位點是非常有希望的藥物作用靶點[2]。MIF晶體結構最早于1996年被Sun等解析[3]，為由3個相同亞基組成的桶狀結構的三聚體，催化活性中心位于相鄰亞基之間。

RA是以慢性、對稱性多滑膜關節炎和關節外病變為主要臨床表現的疾病。目前西醫治療尚無特效方法，且長期服藥不良反應較大。中醫藥在防治RA方面療效較好[4]。但中藥有效成分較為復雜，藥物作用機制難以闡明。隨著生物信息學和計算機輔助藥物設計等學科的發展，藥物與靶標作用機制能以更直觀的方式呈現。獨活是重要的祛風濕藥，《本草匯言》載“獨活，善行血分，祛風行濕散寒之藥也”。本研究使用小分子虛擬篩選與分子動力學模擬等技術探索獨活中MIF抑制劑小分子，以探究獨活治療RA等疾病的作用機理。

1 ?資料與方法

1.1 ?操作平臺與軟件

操作平臺為Linux系統，采用OpenBabelGUI2.4.1進行小分子修飾，Pyrx0.8進行虛擬篩選，NAMD2.13進行分子動力學模擬，VMD1.9.3、Discovery studio4.5及Ligplot+1.4.5進行對接結果及動力學模擬結果分析。

1.2 ?獨活小分子數據庫建立

獨活小分子數據來源于中國臺灣中醫藥資料庫TCM Database@Taiwan（http：//tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/ index.php）。該數據庫是目前全世界最大的可直接用于虛擬篩選和分子動力學模擬的中醫藥小分子數據庫，含中藥443種、中藥小分子化合物2萬多種。該數據庫可提供中藥成分查詢，或已知某種成分，查詢含有該成分的中藥。進階查詢提供以結構為基礎的查詢，使用者可在線畫出要查詢的主結構，再輸入限制條件，如分子量、分子體積、Log P、氫鍵接受體數目等，進行復合式查詢[5]。

建立獨活小分子數據庫。下載獨活有效成分小分子mol2文件后使用OpenBabelGUI2.4.1軟件將其轉換為sdf文件等待對接。

1.3 ?受體蛋白數據建立

從RCSB PDB數據庫搜索MIF蛋白結構信息，選擇人源型、鑒定方法為X射線衍射法、分辨率>2.6 ?的結構。最終確定PDB ID為1LJT的蛋白晶體結構為對接受體蛋白。該蛋白結構含MIF蛋白與3個配體小分子，每個配體小分子鑲嵌在2個亞基之間。使用Discovery studio軟件將蛋白與配體小分子分離后另存為單獨pdb文件，然后計算小分子的結構中心數據并保存。使用Pyrx軟件導入分離后的受體與配體結構并轉存為對接文件，設置對接中心為配體中心，對接半徑為5?，Exhaustion參數設為8，運行Autodock Vina對接模塊。對接結束后選擇Binding Affinity第一的結果并使用VMD計算該結果與原配體的均方根偏差（RMSD）值，得出RMSD=1.14 ?，提示原配體可較好地還原到對接口袋中，設置的對接參數合理[6]。

1.4 ?獨活小分子成分虛擬篩選

將收集到的獨活小分子導入Pyrx并進行能量優化，然后保存為對接小分子。再次使用Vina程序將包括原配體小分子在內的所有小分子與MIF大分子受體進行對接，其中原配體作為陽性對照小分子，對接參數為原參數。對接結束后按Binding Affinity能量值由低到高排序，選取能量低于原配體的小分子并單獨保存為pdb文件。將得到的小分子分別還原到結合口袋中，分別使用Discovery studio軟件和Ligplot+[7]軟件分析小分子與受體相互作用關系三維與二維構像圖，并分析主要作用殘基和作用力。

1.5 ?分子動力學模擬

使用NAMD[8]對對接能量最低的小分子與受體的復合體結構進行10 ns分子動力學模擬，觀察復合物的穩定性。首先分析小分子結構并編寫相應的拓撲文件與力場參數文件，再將復合物加入立方體水盒子中，同時加入平衡離子使整體電荷為中性，平衡離子為NaCl，并生成psf文件。浸入水盒子的復合物模型構建完成后先進行1000步（Timestep）的能量優化，然后再進行動力學模擬。模擬中使用的力場主要為CHARMM力場，時間步長設置為2 fs，其他參數設為默認值，模擬結束后分析RMSD值。

2 ?結果

2.1 ?分子對接結果

本研究從數據庫下載獨活有效成分小分子84個，對接結束后得到結合能低于原配體的小分子4個，其結合能與結構信息見表1。結果顯示原配體結合能為-8.3 kcal/mol，高于其結合能的4個小分子共有7種結合構像，其中排名第二的小分子（Z）-3-（6-Hydroxy- 1-benzofuran-5-yl）acrylaldehyde共有4種。而親和力最高的為（Z）-3-[（R）-6-Hydroxy-2-isopropyl-2，3-dihydro- 1-benzofuran-5-yl]acrylaldehyde小分子，其結合能為-9.4 kcal/mol。

2.2 ?相互作用分析

排名第二的小分子有4種構像，僅顯示結合能較小的構像。小分子在受體蛋白中結合位點見圖1。可以看出，4個小分子均鑲嵌到了MIF蛋白2個亞基之間的連接處，結合較緊密。

小分子與蛋白作用殘基三維與二維結構見圖2、圖3。相互作用殘基表明，產生疏水作用殘基主要為TYR36、TYR95、PHE113、VAL106、MET101、ILE64、LYS32、PRO1，正靜電勢主要在LYS32殘基附近。序號1小分子與ILE64上的N原子和LYS32上的NZ原子形成氫鍵，鍵長分別為3.10 ?和2.92 ?。序號2小分子與LYS32上的NZ原子形成氫鍵，鍵長為2.92 ?。氫鍵是維系蛋白質與配體分子穩定性的重要作用力，一般氫鍵的鍵能為2～8 kcal/mol，不同原子的鍵能不同。提示序號1與序號2的結合能差別主要在于氫鍵。

2.3 ?分子動力學模擬

能量優化結果見圖4，在1500 fs時能量基本達最低值，提示能量優化較徹底，優化后的結構可進行動力學模擬。

復合物RMSD值波動圖見圖5，其均值為（1.53±0.18）?。約5 ns后整個復合物趨于穩定，無較大波動，提示小分子與MIF結合后較穩定。

3 ?結論

本研究使用藥物虛擬篩選技術對單味中藥獨活小分子化合物進行虛擬篩選，最后得到4種優于原MIF晶體結構中配體的小分子化合物，對接后的小分子均鑲嵌在MIF 2個相鄰亞基間的活性口袋中。分子相互作用分析結果表明，主要的結合作用力為氫鍵和疏水作用，主要作用殘基有8個。對篩選出來的最佳小分子與受體結合后的模型進行分子動力學模擬，發現受體與配體能穩定結合，提示獨活基于MIF抑制劑的有效抗炎活性成分可能為（Z）-3-[（R）-6-Hydroxy-2- isopropyl-2，3-dihydro-1-benzofuran-5-yl]acrylaldehyde小分子。本研究探索了獨活在抑制MIF活性中的作用機理，可為進一步闡釋獨活治療炎癥和免疫介導疾病的作用機制研究及設計研發MIF抑制劑提供參考。

參考文獻：

[1] DAS R， KOO M S， KIM B H， et al. Macrophage migration inhibitory factor（MIF） is a critical mediator of the innate immune response to Mycobacterium tuberculosis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013， 110（32）：2997-3006.

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[3] SUN H W， BERNHAGEN J， BUCALA R， et al. Crystal structure at 2.6-angstrom resolution of human macrophage migration inhibitory factor[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93（11）：5191-5196.

[4] 邱明山，張倩，陳進春，等.中西醫結合治療活動性類風濕關節炎療效與安全性評估[J].中國中醫藥信息雜志，2016，23（1）：31-34.

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[7] LASKOWSKI R A， SWINDELLS M B. LigPlot+：multiple ligand-protein interaction diagrams for drug discovery[J]. J Chem Inf Model， 2011，51（10）：2778-2786.

[8] MELO M C R， BERNARDI R C， RUDACK T， et al. NAMD goes quantum：an integrative suite for hybrid simulations[J]. Nat Methods，2018， 15（5）：351–354.

（收稿日期：2018-11-03）

（修回日期：2018-11-22;編輯：向宇雁）