腦紅蛋白在糖尿病大鼠視網膜病變發展中的表達變化

劉瓊　于健　陳林江

【摘要】 目的 探討腦紅蛋白（NGB）在糖尿病大鼠視網膜病變發展中的表達變化。方法 30只雄性SD大鼠， 隨機分為糖尿病組（DR組）和正常對照組（N組）， 每組15只。DR組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素STZ構建糖尿病大鼠動物模型。采用原位雜交法、免疫組化、蛋白質印跡法（Western blotting）檢測NGB表達變化和分布特點。結果 誘導12周后， DR組大鼠體重為（309.0±11.0）kg， 明顯輕于N組的（584.1±25.4）kg， 血糖為（30.1±5.4）mmol/L， 明顯高于N組的（7.5±5.3）mmol/L， 差異均有統計學意義（P<0.05）。DR組視網膜組織NGB表達增加， 明顯高于N組， 差異有統計學意義（P<0.01）。原位雜交示DR組神經節細胞層、內核層、外核層、光感受器層可見強陽性表達。結論 在糖尿病大鼠視網膜病變發展過程中， NGB可能參與視網膜的神經保護。

【關鍵詞】 腦紅蛋白;視網膜;糖尿病

【Abstract】 Objective To discuss the expression changes of neuroglobin （NGB） in the development of diabetic rat retinopathy. Methods A total of 30 male SD rats were randomly divided into diabetic group （DR group） and normal control group （N group）， with 15 rats in each group. In DR group， streptozotocin STZ was injected intraperitoneally to establish diabetic rat model. The expression and distribution characteristics of NGB were detected by in situ hybridization， immunohistochemistry and Western blotting. Results After 12 weeks of induction， DR group had obviously lighter rat weight as （309.0±11.0） kg than （584.1±25.4） kg in N group， and obviously higher blood glucose as （30.1±5.4） mmol/L than （7.5±5.3） mmol/L in N group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. DR group had expression of NGB in retina of increased by 55.68% compared with that of N group， and the difference was statistically significant （P<0.01）. Situ hybridization showed strong positive expression in ganglion cell layer， inner nuclear layer， outer nuclear layer and photoreceptor layer of DR group. Conclusion NGB may be involved in retinal neuroprotection during the development of diabetic rat retinopathy.

【Key words】 Neuroglobin; Retina; Diabetes

腦紅蛋白（neuroglobin， NGB）是一種主要分布于腦和視網膜中的特異性攜氧球蛋白， 具有儲存氧氣和促進氧氣向線粒體擴散或直接介導氧氣向線粒體傳遞， 促進腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的產生， 維持神經元正常功能[1]。有研究表明， NGB在視網膜中表達遠高于其他神經組織， 其濃度約為腦內濃度的50～100倍[2]， 而視網膜又是人體內耗氧率最高的組織[3]， 這提示NGB可能與視網膜的氧利用密切相關。糖尿病視網膜病變目前成為主要的致盲疾病之一， 血糖升高導致視網膜血管內皮細胞受損， 周細胞凋亡， 繼而引起視網膜血管滲漏， 視網膜組織水腫， 視網膜缺血缺氧誘發新生血管因子形成， 最終引起視網膜玻璃體出血導致患者視力嚴重受損。因此， NGB作為視網膜的特異性攜氧蛋白是否參與糖尿病視網膜病變的發展是本研究的主要內容。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 選取30只雄性SD大鼠（由南方醫科大學實驗動物中心提供）， 體重200～220 g， 大鼠分籠飼養， 無限制標準鼠食、水飼養， 飼養環境通風， 室溫18～25℃， 相對濕度在50%～70%， 12 h光照晝夜循環。將30只SD大鼠隨機分為正常對照組（N組）和糖尿病組（DR組）， 每組15只。

1. 2 方法

1. 2. 1 動物模型制備 DR組大鼠禁食12 h后， 腹腔注射鏈脲佐菌素STZ（sigma 公司）60 mg/kg， 注射1 d后經鼠尾靜脈采血檢測清晨血糖水平， 每周檢測1次， 至12周。血糖 >15 mmol/L為糖尿病大鼠模型建立成功。

1. 2. 2 免疫組化 12周后， 過量戊巴比妥腹腔注射處死大鼠， 4%多聚甲醛灌注固定后取出眼球， 4%多聚甲醛后固定2 h后， 移至30%蔗糖溶液中4℃過夜沉底， 次日常規石蠟包埋， 切片。石蠟包埋的視網膜組織切片常規二甲苯脫蠟， 酒精梯度脫水， 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）充分漂洗， 置入0.3%過氧化氫37℃孵育30 min， 去除內源性過氧化氫酶活性， 0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次后， 10%正常山羊血清中室溫下孵育30 min， 滴加抗腦紅素蛋白一抗（武漢博士德公司， 1∶50）， 4℃冰箱濕盒中過夜， 次日0.01 mol/L PBS漂洗 5 min×3次， 滴加1∶1000生物素化的羊抗兔二抗（武漢博士德公司）室溫下30 min， PBS漂洗5 min×3次， 辣根酶標記鏈霉卵白素室溫下孵育1 h， PBS漂洗5 min×3次， 3， 3'-二氨基聯苯胺（DAB）顯色3～5 min， 自來水沖洗， 貼片， 晾干， 脫水， 透明， 封片。陰性對照組：用羊血清替代一抗。

1. 2. 3 原位雜交 二甲苯脫蠟， 乙醇水化， 依次經100%、95%、80%、75%乙醇和焦碳酸二乙酯（DEPC-H2O）各1次， 5 min/次， 0.2 mol/L 鹽酸溶液（HCL）室溫處理5 min， PBS洗片3次， 蛋白酶K（40 μg/ml）室溫下孵育20 min后， 含0.2%甘氨酸的PBS洗3次， 5 min/次， 4%多聚甲醛固定10 min后， PBS洗片2次， 醋酸干和三乙酸溶液室溫下孵育10 min， PBS洗片2次， 50℃滴加預雜交液進行預雜交2 h， 50℃過夜雜交， 檸檬酸鈉緩沖液（SSC）洗滌后， 洗膜緩沖液（TBST）洗5次后， 室溫下封閉1 h， 滴加抗地高辛一抗（1∶1000）4℃孵育過夜。TBST洗4次， 堿性磷酸酯酶顯色緩沖液（BCIP/NBT）染色液緩沖液洗2次， BCIP/NBT暗處染色24 h， TE緩沖液（pH 8.0）洗2次終止反應， 核固紅復染5 min， 水洗殘夜， 梯度酒精脫水， 透明封片。鏡檢， 拍照。

1. 2. 4 Western blotting RIPA裂解液裂解組織提取視網膜織總蛋組白， 二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量后， 取各組樣本蛋白30 μg， 進行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后， 電轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）， 在5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h， 加兔抗腦紅蛋白單克隆抗體（1∶1000）， β-肌動蛋白（β-actin）（1∶1000）于一抗稀釋液中， 4℃孵育過夜， TBST沖洗后， 與辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）室溫下孵育2 h， 加化學發光劑曝光顯影。

1. 3 統計學方法 采用SPSS12.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 SD大鼠體重和血糖變化 誘導12周后， DR組大鼠體重為（309.0±11.0）kg， 明顯輕于N組的（584.1±25.4）kg， 血糖為（30.1±5.4）mmol/L， 明顯高于N組的（7.5±5.3）mmol/L， 差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2. 2 正常大鼠視網膜NGB的表達 免疫組化顯示， 正常大鼠視網膜組織中光感受器層， 內、外叢狀層和神經節細胞層可見腦紅素蛋白表達。見圖2。

2. 3 原位雜交 NGB mRNA原位雜交染色的陽性物質呈藍色， 與N組相比較， DR組神經節細胞層、內核層、外核層、光感受器層可見強陽性表達， 主要為細胞質著色。見圖3。

2. 4 糖尿病大鼠NGB的表達變化 Western blotting顯示， DR組視網膜NGB表達增加為（132.46±15.83）， 較N組的（84.79± 16.78）明顯增加， 差異有統計學意義（P<0.01）。見圖4。

3 討論

本研究發現， 在糖尿病大鼠視網膜組織中NGB表達增加， 原位雜交顯示NGB在糖尿病大鼠視網膜神經節細胞層、內核層、外核層、光感受器層表達增加。

糖尿病視網膜病變是糖尿病主要的微血管病變， 也是糖尿病致盲的首要原因。其病理改變包括微血管的改變和視網膜神經細胞的改變。持續的高血糖環境使糖尿病視網膜病變患者微血管發生了異常組織氧合作用從而引起微血管功能改變， 周細胞的丟失、基底膜的增厚和內皮細胞的增生[4-8]。以上改變導致毛細血管完整性遭到破壞， 致使血管腔縮窄和血流改變， 促進糖尿病視網膜病變向后期發展， 發生毛細血管和小動脈閉塞， 導致視網膜的缺血、無灌注形成進而出現新生血管[9]。視網膜神經細胞的病變與微血管病變一樣， 是糖尿病視網膜病變的重要組成部分， 它包括神經細胞的凋亡和神經膠質細胞的改變[10]。糖尿病視網膜病變的發展伴隨著視網膜組織缺血缺氧。

NGB是新近發現的第三類攜氧球蛋白， 其分子結構與血紅蛋白和肌紅蛋白具有同源性， 主要分布在腦、視網膜等神經組織， 在神經系統氧的攝取、運輸和利用等生理過程中起著極其重要的作用， 體內各處NGB表達量的增加均與組織的缺血缺氧密切相關[11]。Sun等[12]研究表明， 體外培養神經元中， 低氧可誘導其NGB表達增高， 顯著增強細胞抗缺氧的能力， 減少神經細胞的損傷;反義核酸封閉NGB的表達， 則導致細胞對缺氧損傷更為敏感。視網膜組織作為耗氧大的組織， 其NGB的表達遠遠高于腦組織。有研究表明， NGB除視網膜色素上皮和光感受器外節外， 在視網膜各層均有表 達[13]， 本研究也得到了相似的結果。本研究還發現， NGB在糖尿病大鼠視網膜神經節細胞層、內核層、外核層、光感受器層表達顯著增加。Chan等[14]研究發現， NGB轉基因鼠視網膜中， NGB過表達位于視網膜神經節細胞， 內外叢狀層， 光感受器內節中， NGB轉基因鼠視網膜NGB過表達可以減少因急性視網膜缺血引起的線粒體損傷， 從而抑制細胞凋亡。也有學者認為， NGB具有清除一氧化氮（NO）的功能， 參與NO的代謝過程， 從而減少NO對線粒體的損傷， 并且保護神經元及細胞來抵抗氧化應激[15]。

因此， 作者認為， 缺氧條件下誘導NGB表達增加， NGB可以通過為視網膜神經細胞提供氧， 保護線粒體功能， 減少細胞凋亡， 從而在糖尿病視網膜病變發展過程中起到神經保護作用。而NGB這種保護作用的機制有待進一步研究。

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[收稿日期：2019-01-15]