三叉神經(jīng)節(jié)遞質(zhì)的UHPLC-MS/MS法測定

付曉蕓　唐雪　李星影　畢祿莎　孫嘉茵　徐小平

摘要：該文采用UHPLC-MS/MS建立一種同時測定大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中4種神經(jīng)遞質(zhì)的方法。SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)組織勻漿后，加乙腈沉淀蛋白，制備成供試品溶液;以Discovery HS F5-3（2.1mm×150mm，3.0μm）為色譜柱，0.1%甲酸溶液（A相）和0.1%甲酸-40%乙腈溶液（B相）為流動相，梯度洗脫進(jìn)行分離;然后在+ESI和MRM模式下檢測，以 Glycine-N¹⁵為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果表明：4種氨基酸的線性關(guān)系良好（r²≥0.999），檢測限和定量限分別為0.14～1.23ng/mL和0.47～4.11ng/mL;在濃度范圍內(nèi)，進(jìn)樣精密度、日內(nèi)和日間精密度良好，RSD分別在0.90%～5.17%，3.01%～7.19%，4.64%～14.49%;加樣回收率為94.8%～108%。大鼠三叉神經(jīng)節(jié)炎癥模型在0，1，3，5，7d4種神經(jīng)遞質(zhì)的含量均發(fā)生不同程度的變化，其中天門冬氨酸（Asp）在炎癥期沒有明顯的變化（P>0.05），而其余3種遞質(zhì)變化顯著（P<0.05），且谷氨酸（Glu）最明顯，體外實驗也證實Glu在炎癥條件下含量增加。所建方法可高效同時分離檢測三叉神經(jīng)中4種氨基酸的含量，有較好的使用價值。

關(guān)鍵詞：氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì);三叉神經(jīng);超高效液相色譜;三重四極桿質(zhì)譜

中圖分類號：O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）01-0064-06

0 引言

生活中常說的“臉痛”即三叉神經(jīng)痛（trigeminalnerve pain，TN），是一種反復(fù)發(fā)作在面部三叉神經(jīng)分布區(qū)內(nèi)的陣發(fā)性劇烈神經(jīng)痛，是中樞系統(tǒng)常見病之一[1-21。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布大量的氨基酸，這類物質(zhì)具有獨特的神經(jīng)遞質(zhì)作用，主要包括興奮性氨基酸[3]如谷氨酸[4]天冬氨酸和抑制性氨基酸Y-氨基丁酸[5]、牛磺酸等兩大類，當(dāng)面部出現(xiàn)疼痛時，這些神經(jīng)遞質(zhì)亦會發(fā)生相應(yīng)變化。三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（trigeminal ganglion neurons，TGNs）是假單極神經(jīng)元，其胞體位于三叉神經(jīng)節(jié)，由大量衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞（satellite glia cells，SGCs）包裹。研究表明，口腔領(lǐng)面部的創(chuàng)傷、炎癥等刺激因素可以通過軸突運(yùn)輸?shù)耐緩接绊懭嫔窠?jīng)節(jié)內(nèi)TGNs-SGCs的交互對話，Glu是參與TGNs-SGCs交互對話的重要信號分子;所以，建立谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)的檢測方法可為三叉神經(jīng)疼痛機(jī)理的研究提供學(xué)術(shù)基礎(chǔ)。國內(nèi)外對氨基酸分析測定方法有不少報道，主要有分光光度法[6]、柱前柱后衍生高效液相色譜（HPLC）法[7]、氨基酸分析儀法[8]、離子色譜法[9]、液質(zhì)聯(lián)用法[10-11]、超高效液相色譜[12]等，但是針對三叉神經(jīng)內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的同時檢測尚未見發(fā)表。由于神經(jīng)節(jié)小，含量低且干擾多[13-14]，本文擬采用UHPLC-MS/MS法快速定量大鼠三叉神經(jīng)組織內(nèi)以及TGNs-SGCs共培養(yǎng)體系內(nèi)4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在疼痛前后的含量變化，通過對比炎癥組與空白對照組的氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的含量差異，可為三叉神經(jīng)支配區(qū)域內(nèi)疼痛異常提供神經(jīng)遞質(zhì)的定量變化基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津超高效液相色譜儀LC-30A與三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8050聯(lián)用系統(tǒng)：MTN-2008D氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）;KQ-500B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;R201B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝生物技術(shù)有限公司）;HL104和XS205電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）：MaxiMix Ⅱ渦旋振蕩器（賽默飛世爾科技有限公司）;Milli-Q純水儀（美國Milli-Q公司）。

甘氨酸（Gly）對照品，谷氨酸（Glu）對照品，Y-氨基丁酸（GAGA）對照品，天門冬氨酸（Asp）對照品（中國食品藥品檢定研究院）;Glycine-N"（98%，Sigma-Aldrich）;乙腈、甲醇（色譜級，賽默飛世爾科技有限公司）;乙醇、甲醇（分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司）;乙酸銨（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;甲酸（98%，LC-MS專用，百靈威科技有限公司）;甲酸（分析純，程度科龍化工試劑廠）：Matrigel basement membrane matrix（BD生物科技，美國）：木瓜蛋白酶（Sigma，美國）：Neurobasal-A培養(yǎng)基（Gibco，美國）。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液的配置

分別取Gly，GABA，Asp，Glu對照品適量，配制成質(zhì)量濃度為0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用超純水逐級稀釋至10，20，50，100，200，500，1000，2000，4000ng/mL，即為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

取Glycine-N¹⁵適量，精密稱定，超純水配制成質(zhì)量濃度20μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.3 樣品處理方法

取三叉神經(jīng)節(jié)組織稱重，置于勻漿管中，精密加入生理鹽水1mL，勻漿后，吸取大鼠三叉神經(jīng)組織勻漿液100μL，加入20μL內(nèi)標(biāo)工作液，再加入880μL乙腈，渦旋1min，14000r/min離心10min，取上清液20μL，進(jìn)樣LC-MS-MS，記錄色譜圖和質(zhì)譜圖，以質(zhì)譜峰面積進(jìn)行計算。

1.3 色譜條件的考察

實驗通過單因素考察，對色譜柱、流動相的比例、有機(jī)溶媒的極性和緩沖鹽的強(qiáng)度等進(jìn)行篩選。

1.3.1 色譜柱的選擇

流動相均以0.1%甲酸（FA）作為水相，含有0.1%FA的乙腈或甲醇為有機(jī)相，流量0.2mL/min，以樣品中主成分峰的保留時間（t_R）、柱效（N）、拖尾因子（T）作為指標(biāo)分別對色譜柱1^#：HILIC柱（SepaxPolar-Silica，4.5mm×150mm，3μm）：色譜柱2^#：五氟苯基柱（Ultimate PFP，2.1mm×50mm，3μm）;色譜柱3^#：五氟苯基柱（Discovery HS F5-3，2.1mm×150mm，3.0μm）進(jìn)行考察。

1.3.2 有機(jī)相的選擇

選擇1.3.1獲得的最佳色譜柱，以0.1%甲酸（FA）作為水相，樣品中以4個氨基酸峰祎t_R、N、T作為指標(biāo)考察乙腈和甲醇對分離過程的影響。

1.3.3 緩沖鹽濃度的選擇

選擇1.3.1獲得的最佳色譜柱，以0.1%甲酸（FA）作為水相，1.3.2項下最優(yōu)的有機(jī)相，考察了0.1%FA溶液中添加不同濃度乙酸銨的影響。

1.4 色譜條件

色譜柱：Discovery HS F5-3，2.1mm×150mm，3.0μm;流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為0.1%甲酸-40%乙腈溶液;流量：0.20mL/min;進(jìn)樣體積：2μL;柱溫：40℃;混合器體積：180μL;洗脫方式：梯度洗脫，如表1所示。

1.5 質(zhì)譜條件

采用+ESI離子化模式和多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式;碰撞氣：氬氣，270kPa;接口溫度：300℃;DL溫度：250℃;加熱模塊溫度：400℃;接口電壓：4.0kV;參數(shù)見表2。

2 方法學(xué)驗證

2.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

取1.2.1中的標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，加內(nèi)標(biāo)液制成質(zhì)量濃度為1，2，5，10，20，50，100，200，400ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，經(jīng)測定計算各自線性方程，并經(jīng)不斷稀釋檢測出儀器的檢出限（S/N≥3）和定量限（S/N≥10）結(jié)果。

2.2 精密度和準(zhǔn)確度

以高中低3個濃度的AA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)6次進(jìn)樣;以制備的高中低3組供試品溶液在同一日反復(fù)檢測6次，于不同日測定，分別計算進(jìn)樣精密度、日內(nèi)和日間精密度。精密量取大鼠三叉神經(jīng)組織勻漿液80μL，離心管，加內(nèi)標(biāo)液20μL，加標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL，然后照1.2.3項下處理，制備高中低3個濃度的加標(biāo)樣品，按照1.4和1.5項下條件分析，測定加樣回收率。

3 神經(jīng)遞質(zhì)的檢測

3.1 動物模型的選擇

以常見SD大鼠作為疼痛實驗?zāi)Ｐ蚚15-16];體重：160～180g。

3.2 三叉神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)遞質(zhì)的檢測

實驗設(shè)計了炎癥0，1，3，5，7d的大鼠模型，動物在全麻條件下取出三叉神經(jīng)，每組8份樣品，組織樣品照1.2.3方法制備，照1.4和1.5項下測定條件檢測。并使用SPSS軟件進(jìn)行配對樣本T檢驗，以判斷炎癥Od與炎癥1，3，5，7d數(shù)據(jù)是否具有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。

3.3 TGNs-SGCs細(xì)胞培養(yǎng)基中神經(jīng)遞質(zhì)的檢測

本文利用TGNs-SGCs共培養(yǎng)體系，體外模擬驗證Glu在炎癥條件下的代謝變化。實驗中取新鮮獲取的三叉神經(jīng)節(jié)，經(jīng)木瓜蛋白酶溶液處理后加入Neurobasal-A培養(yǎng)基2mL重懸混勻。用Matrigel接種細(xì)胞懸液。置于37℃、5% CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～48h獲得供試培養(yǎng)液。取供試培養(yǎng)液少許，照1.4，1.5項檢測不同培養(yǎng)時間，培養(yǎng)液中Glu的含量變化。

4 結(jié)果討論

4.1 液相色譜條件的選擇

色譜柱的選擇由表3可知，在相應(yīng)的較優(yōu)的流動相條件下，五氟苯基柱（Discovery HS F5-3，2.1mm×150mm，3.0μm）得到的評價指標(biāo)更優(yōu)，柱效更高，峰形對稱度更好，更適合后續(xù)進(jìn)行條件篩選。有機(jī)相的選擇由表4可知，含40%的乙腈作為有機(jī)相，出峰情況好，柱效高。由表5可知，隨著緩沖鹽濃度的增加，離子強(qiáng)度上升，4種氨基酸的保留時間都隨離子強(qiáng)度增大而減小，加入緩沖鹽后對各種氨基酸的各項評價指標(biāo)沒有明顯提升，故采用不加入緩沖鹽的0.1%FA作為水相。

4.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖

由1.5的質(zhì)譜條件獲得氨基酸各自相應(yīng)的總離子流圖，如圖l所示。

4.3 方法學(xué)驗證

由表6，表7可知，四種氨基酸在濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好（r²≥0.999），檢測限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.14～1.23ng/mL和0.47～4.11ng/mL。比傳統(tǒng)的氨基酸測定方法[17-18]的檢測限、定量限更低，說明本實驗采用的方法更靈敏高效。高中低3個不同濃度進(jìn)樣精密度、日內(nèi)和日間精密度的RSD分別在0.90%～5.17%，3.01%～7.19%，4.64%～14.49%：加樣回收率為94.8%～108%之間。

4.4 神經(jīng)遞質(zhì)的檢測

三叉神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)遞質(zhì)的檢測，由表8可知，4種氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)中天門冬氨酸（Asp）炎癥模型中沒有明顯的變化（P>0.05），其余3種神經(jīng)遞質(zhì)在炎癥的1d未表現(xiàn)出明顯的變化外，在炎癥3，5，7d均表現(xiàn)出的顯著變化（P<0.05）。由圖2可知，疼痛過程中谷氨酸（Glu）的濃度在3d后明顯增高。甘氨酸（Gly）、γ-氨基丁酸（GAGA）的濃度略有增加。TGNs-SGCs細(xì)胞培養(yǎng)基中神經(jīng)遞質(zhì)的檢測結(jié)果如圖3所示。可知，在炎癥條件下神經(jīng)元體外培養(yǎng)48h后，實驗組的Glu含量明顯高于空白對照組，與三叉神經(jīng)疼痛趨勢和節(jié)中神經(jīng)遞質(zhì)的表現(xiàn)趨勢相同。

5 結(jié)束語

本文采用UHPLC-MS/MS法首次同時分離檢測三叉神經(jīng)節(jié)中4種氨基酸的含量。采用優(yōu)化后的色譜條件，檢測得到三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)Asp炎癥Od與炎癥1，3，5，7d沒有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。Glu的濃度在炎癥刺激3d后明顯增高，體外實驗同樣證實了Glu在炎癥條件下的代謝變化。說明Glu的含量與疼痛異常行為密切相關(guān)，與炎癥變化進(jìn)展相符[19]，另有研究發(fā)現(xiàn)中風(fēng)、腦組織損傷、癲痛、帕金森病等病理過程突觸間隙Glu含量都增高[20-21]。此外，Gly、GABA的濃度略有增加，說明兩者作為抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)，在炎癥下釋放增加，抑制系統(tǒng)功能增強(qiáng)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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