干預措施對噪聲污染大鼠腦組織基因表達及去甲腎上腺素水平的影響

俞發榮,李建軍,YU Xin ,連秀珍,謝明仁,*,李登樓,陳望軍,郭蘊萱

1.甘肅政法學院 甘肅省證據科學技術研究與應用重點實驗室,蘭州730070

2.University of Southern California,Los Angeles 90033,USA

0 前言

隨著人們物質文化生活水平的日益提高,噪聲污染對人類與生物界影響日趨嚴重[1]。噪聲信號激發并引起聽覺系統的興奮,通過杏仁核激發下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA-軸) 釋放應激激素[2],促進去甲腎上腺素(NA)的合成釋放,較高濃度的NA 一方面使機體出現精神緊張和內分泌系統失調,導致組織器官的損傷[3],另一方面激活去甲腎上腺素轉運蛋白(NAt)回收運轉NA,加速NA 的合成。中樞及周圍神經系統的神經元受損時,腦組織內的腦源性神經營養因子( brain derived neurotrophic factor,BDNF) 和其高親和力受體-酪氨酸激酶受體 B(tyrosine kinase B,TrkB)水平發生變化,防止神經元受損死亡,改善神經元的病理狀態,促進受損傷神經元再生及分化等生物效應,維持中樞及周圍神經系統的神經元生存及正常生理功能。為了進一步探索引起腦組織損傷的噪聲強度和NA、Nat、BDNF、TrkB 水平的關系,尋找預防噪聲污染對組織損傷的干預措施和方法,用Wistar 為實驗對象,給予國家規定的環境噪聲排放標準以內的噪聲,觀察對腦組織中基因表達的影響,為環境治理和環境保護以及政府主管部門制定預防和控制噪聲污染措施提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級Wistar 大鼠50 只,體重180—190 g,6周齡,雌雄各半。來源于甘肅中醫藥大學科研實驗中心【SCXK (甘)2015—0001】,實驗在甘肅政法學院SPF 級實驗室進行【SYXK (甘)2015—0006】。本實驗所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》規定,按3R 原則給予實驗動物使用的人文關懷(倫理委員會審批號碼:GZF—2017—006)。

1.1.2 試劑與儀器

去甲腎上腺素(noradrenaline,NA)、去甲腎上腺素轉運蛋白(noradrenaline transporter,NAt)、腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase B,TrkB)試劑盒,購于北京索寶生物科技有限公司;利血平(reserpine),廣東邦民制藥廠有限公司;UFX7103 AAW 音頻信號發生器,上海電子教學儀器廠;TES—1352S 低頻聲計儀,泰仕電子工業股份有限公司;MK3-酶標儀,上海儀器有限公司;噪聲刺激盒自制[4]。

1.2 實驗方法

全部動物在SPF 級實驗室IVC 飼育籠內飼養(籠內溫度23℃ ± 1 ,℃ 濕度55%),每籠2 只,自由飲水進食,自然光照,適應7 d。按抓鬮法將Wistar 大鼠分為5 組,每組10 只大鼠(雌雄各半)。空白對照組:不給噪聲刺激,在實驗當天早上灌胃蒸餾水10 mL·kg-1體重;噪聲污染組(分為30、60、80 dB 三個組):在實驗當天早上灌胃蒸餾水10 mL·kg-1體重,每天15:30 開始,分別將各組大鼠放入自制的噪聲刺激盒給予相應的噪聲刺激,每組每次30 min,每天1 次;干預組(利血平+80 dB):在實驗當天早上按利血平半數致死量(LD50)的 1/100(用無菌水配制,20 mg·L-1),灌胃(20 mL·L-1體重),下午給予80 dB 的噪聲刺激。連續刺激15 d。實驗第16 天,全部動物用乙醚麻醉,無痛打開顱腔,取腦,放入含4%多聚甲醛-1.25%戊二醛0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.4)固定液固定24 h,參照大鼠腦立體定位圖譜[5],切取大腦前額葉皮質(prefrontal cortex,PFC)、海馬(hippocampus,Hipp)組織各5 mg,研磨成勻漿,3000 r·min-1離心20 min,取上清用去甲腎上腺素(NA)、去甲腎上腺素轉運蛋白(NAt)、腦源性神經營養因子(BDNF)和酪氨酸激酶受體B(TrkB)試劑盒測定其吸光度(OD)。分別以NA、NAt、BDNF 、TrkB 標準液濃度為橫坐標,吸光度(OD)為縱坐標做標準曲線和標準曲線的直線回歸方程。分別將各組大鼠腦組織吸光度值代入直線回歸方程,計算出NA、NAt、BDNF、TrkB 水平。

1.3 統計學分析

實驗數據采用SPSS 17.0 軟件進行統計學處理。組間差異采用單因素方差分析,用均數±標準差(±s)表示,噪聲污染對大鼠腦組織NA、NAt、BDNF、TrkB 水平的影響程度用百分比表示,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 利血平對噪聲污染大鼠腦組織去甲腎上腺素(NA)水平的影響

NA 標準曲線的直線回歸方程為:Y=3.2×10-3x+1.34×10-2,R2=0.9989。分別將30、60、80 dB 組 腦組織吸光度(OD)代入方程,大鼠大腦前額葉皮質(PFC)和海馬(Hipp)NA 水平比對照組分別升高了29.62%、76.96%、93.57%和15.29%、55.08%、70.13%;先給予利血平再給予80 dB 噪聲刺激,大鼠大腦前額葉皮質(PFC)和海馬(Hipp)NA 水平比對照組分別降低了46.71%和62.06%;(圖1)。

2.2 利血平對噪聲污染大鼠腦組織去甲腎上腺素轉運蛋白(NAt)水平的影響

NAt 標準曲線的直線回歸方程為:Y=1.4 ×10-3x+ 1.69×10-2,R2=0.9993;分別將30、60、80 dB 組腦組織吸光度(OD)代入方程,大鼠大腦前額葉皮質(PFC)和海馬(Hipp)NAt 水平比對照組分別升高了22.87%、50.35%、94.65%和12.00%、31.76%、61.83%;先給予利血平再給予80 dB 噪聲刺激,大鼠大腦前額葉皮質(PFC)和海馬(Hipp)NAt 水平比對照組分別降低了33.66%和52.06%,(圖2)。

2.3 利血平對噪聲污染大鼠腦組織腦源性神經營養因子(BDNF)水平的影響

BDNF 標準曲線的直線回歸方程為:Y=1.0×10-3x+ 1.33×10-2,R2=0.9986;分別將30、60、80 dB 組腦組織吸光度(OD)代入方程,大鼠大腦前額葉皮質(PFC)和海馬(Hipp)BDNF 水平比對照組分別升高了24.87%、39.27%、67.41%和44.97%、80.81%、95.84%;先給予利血平再給予80 dB 噪聲刺激,大鼠大腦前額葉皮質(PFC)和海馬(Hipp)BDNF 水平比對照組分別升高了16.36%和14.34%,升高程度明顯低于噪聲污染組,(圖3)。

圖1 利血平對噪聲污染大鼠腦組織去甲腎上腺素(NA)水平的影響 Figure1 Effect of reserpine on NA levels in brain tissue of noise-contaminated rats( note：*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group).

圖2 利血平對噪聲污染大鼠腦組織去甲腎上腺素轉運蛋白(NAt)水平的影響 Figure2 Effect of reserpine on NAt levels in brain tissue of noise-contaminated rats(Note：*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group.

圖3 利血平對噪聲污染大鼠腦組織腦源性神經營養因子(BDNF)水平的影響 Figure3 Effect of reserpine on BDNF levels in brain tissue of noise-contaminated rats(note：*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group.)

2.4 利血平對噪聲污染大鼠腦組織酪氨酸激酶受體B(TrkB)水平的影響

TrkB 標準曲線的直線回歸方程為:Y=1.1×10-3x+ 1.19×10-2,R2=0.9993。分別將30、60、80 dB 組腦組織吸光度(OD)代入方程,大鼠大腦前額葉皮質(PFC)和海馬(Hipp)TrkB 水平比對照組分別升高了32.64%、59.95%、82.64%和31.02%、57.31%、80.23%;先給予利血平再給予80 dB 噪聲刺激,大鼠大腦前額葉皮質(PFC)和海馬(Hipp)TrkB 水平比對照組分別升高了4.75%和10.52%,升高程度明顯低于噪聲污染組,(圖4)。

3 討論

圖4 利血平對噪聲污染大鼠腦組織酪氨酸激酶受體B(TrkB)水平的影響 Figure4 Effect of reserpine on TrkB levels in brain tissue of noise-contaminated rats(note.*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group.)

噪聲污染直接和間接影響著人們的身心健康和生活質量[6],增加人們精神和心理壓力[7],引起人們,尤其是兒童睡眠障礙,睡眠不足會導致內分泌和代謝紊亂[8]。噪聲對神經系統的不良影響與噪聲強度呈劑量-依賴關系[9],噪音不僅導致聽力障礙[10],還能引起高血壓[11]、缺血性心臟病[12],導致人們情緒波動、恐懼和精神疾病[13]。流行病學調查結果表明,65 dB(A)以上的噪聲可增加冠心病發病率[14]和患心血管疾病的風險[15],增加死亡率[16]。噪聲污染提高交感神經興奮性,使血壓升高[17],當噪聲水平為50 dB 時,通過應激反應使腎上腺素和去甲腎上腺素水平升高,血管收縮導致血壓升高,增加心肌梗死的風險[18]。神經生理學研究表明,腦內去甲腎上腺素能神經元胞體通過纖維投射分布到下丘腦、海馬和額葉等腦區。給予大鼠單胺氧化酶抑制劑,提高了突觸間的去甲腎上腺素(NA)濃度,去甲腎上腺素轉運蛋白(NAt)的表達也隨之增加[19]。NAt 作為交感 神經突觸前膜上的一種微量膜蛋白,其功能是將神經元釋放的NA 再攝取回突觸前膜中,調控突觸間隙中的NA濃度,終止神經沖動信號,維持受體對神經遞質的敏感性。NAt 是交感神經神經遞質信號傳導的重要環節,在維持正常心血管系統正常功能發揮重要作用。實驗結果發現,在噪聲的刺激下,去甲腎上腺素(NA)、去甲腎上腺素轉運蛋白(NAt)、腦源性神經營養因子(BDNF)和酪氨酸激酶受體B(TrkB)水平均升高,與噪聲強度呈劑量-依賴關系。結果說明,隨著噪聲強度的增加,腦組織內去甲腎上腺素升高,引起去甲腎上腺素轉運蛋白活性增加,將去甲腎上腺素攝取運回突觸前膜,維持突觸間去甲腎上腺素正常水平;腦源性神經營養因子(BDNF)和酪氨酸激酶受體B 水平升高,保護腦組織細胞免受噪聲損傷。當給予利血平后,去甲腎上腺素水平明顯降低或耗竭。結果提示,去甲腎上腺素(NA)是噪聲污染引起腦組織器官損傷的體內主要因素,腦源性神經營養因子和酪氨酸激酶受體B 防止神經元受損死亡,改善神經元的病理狀態,利血平使去甲腎上腺素耗竭,保護組織器官免受噪聲污染的損傷。