重金屬鎘和鉛脅迫對海洋微藻的毒性效應研究

蔡卓平,劉偉杰,駱育敏,吳皓,刁盼盼,段舜山

1.廣東省生態學會,廣州 510600

2.暨南大學生態系,廣州 510632

0 前言

隨著人類社會經濟的快速發展,重金屬的環境污染問題日趨突出,已引起人們廣泛的關注。重金屬污染物最終可能會匯入海洋,對海洋生物產生毒害,破壞海洋生態系統的結構和功能。海洋生態系統中的重金屬來源主要有陸源輸入、天然源和大氣沉降,其中陸源輸入是海洋重金屬污染的常見來源[1-2]。海洋環境中監測到的重金屬污染物通常有鎘、鉛、銅、鋅、汞、鉻等,它們具有環境殘留時間長、難以降解、可沿著食物鏈傳遞富集、危害不可逆性等特點。例如重金屬鉛Pb 能導致生物中樞神經系統損壞,也能引起腎臟、肝臟和大腦功能的衰竭;重金屬鎘Cd對人類可以產生“三致性”危害(致癌、致畸、致突變)。這些重金屬污染物進入近海水體后,可通過食物鏈傳遞,威脅到人類健康[3-4]。海洋微藻是海洋生態系統最主要的初級生產者,此外,它們對毒物敏感性強,繁殖迅速,生長周期短,容易獲得,因此它們也被認為是一種很好的化學品風險測試生物[5]。米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)屬于甲藻門,裸甲藻目,凱倫藻屬,營游泳生活,細胞長15.6—31.2 μm,寬 13.2—24 μm,是常見的有毒、有害赤潮藻,屬世界廣布種,常見于溫帶和熱帶淺海水域。其早于1935年在日本地區的海灣被發現,隨后在美洲灣、英吉利海峽等全球海域都被發現,1998年中國南海大鵬灣、深圳灣、珠江口及內伶仃島等一帶海域也發生過較大規模的米氏凱倫藻赤潮[6]。米氏凱倫藻具有較強的環境適應能力,其誘發的赤潮給沿海國民經濟造成了巨大的損失,也給人們的健康帶來威脅。本文選用米氏凱倫藻為生物研究材料,設置不同濃度的重金屬鎘和鉛處理,重點研究重金屬Cd2+和Pb2+脅迫對藻細胞生長的影響,分析重金屬脅迫下藻體內抗氧化酶和光合效應的變化情況,希望為了解重金屬脅迫對海洋微藻的毒性效應提供參考和積累數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗生物材料米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)取自暨南大學生命科學技術學院水生生物研究中心藻種室。微藻培養所用的人工海水經高壓濕熱滅菌,冷卻后用于微藻的培養。玻璃三角瓶預先用稀HCl浸泡24 h,經蒸餾水沖洗干凈,烘干、滅菌備用。將已知起始密度的目標藻種分別接種于添加f/2 培養基的滅菌人工海水中,玻璃三角瓶放置在人工氣候光照培養箱中靜止培養,培養溫度為(23±1) ,℃ 光照強度約為80 μmol·m-2·s-1,光暗周期為12h:12h。每日定期搖晃玻璃三角瓶,隨機改變其位置以減少其他因素作用。實驗開始前預先對藻種活化及擴大培養,并選取對數生長期的海洋微藻用于實驗。所用的CdCl2和PbCl2均購自上海阿拉丁試劑有限公司,分析純,純度≥99.8%。

1.2 研究方法

培養基經高壓蒸汽滅菌冷卻后,分裝于150 mL玻璃三角瓶中,每瓶100 mL。選取對數生長期藻種進行接種,初始接種濃度為1.0×105個·mL-1。重金屬離子的工作液由儲備液由培養基稀釋得到,根據預實驗設置重金屬Cd2+濃度梯度為0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1;設置Pb2+濃度梯度為0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1。每個處理(含對照組)設置3 個平行重復,培養96 h。利用細胞計數觀測藻細胞的生長繁殖,并繪制生長曲線并計算比生長速率(μ)。比生長速率(μ)以藻細胞數均值為基礎數據,按照下面公式進行計算:

式中:Nt和N0分別為t(96 h)時刻和t0(初始接種)時的藻細胞數。在比生長率速率基礎上,采用概率單位-濃度對數法繪制曲線,根據線性回歸方程計算96 h的半數抑制濃度(EC50)。

參照有關文獻[7-8]測定不同濃度重金屬Cd2+和Pb2+對米氏凱倫藻葉綠體色素含量的影響。取10 mL培養96 h 的藻液,經高速冷凍離心機4 ℃,5000 g 離心15 min,棄上清液,加入5 mL 抽提液(丙酮:乙醇= 1:1),震蕩搖勻之后,4 ℃黑暗靜置24 h 后,同條件離心15 min,取上清液,用紫外-可見光分光光度計UV2450 測定440、645、663 nm 波長下上清液的吸光值,以抽提液作為空白對照,參照以下公式計算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和類胡蘿卜素(Car)的含量(mg·L-1):

受試藻種不同濃度重金屬Cd2+和Pb2+暴露處理96 h 后,取2 mL 藻液轉移至專用測量小瓶,于暗箱中暗適應30 min,利用植物效率儀(PAM)在室溫下進行測定,由3000 μmol·m-2·s-1的連續光誘導,熒光信號記錄從10 μs 開始,至2 s 結束。記錄最大光能轉化效率(Fv/Fm)值。重金屬Cd2+和Pb2+暴露處理米氏凱倫藻96 h 后,采用南京建成公司相應的試劑盒,參照操作手冊測定藻體超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)的含量。

1.3 數據統計

采用SPSS 軟件進行統計分析,結果以平均值±標準誤差 (Mean±SE)表示。

2 結果與分析

2.1 重金屬鎘和鉛脅迫對米氏凱倫藻細胞生長的毒性效應

隨著實驗時間的延長,不同重金屬處理下米氏凱倫藻的細胞密度均呈現增長趨勢(圖1),表明米氏凱倫藻對重金屬鎘、鉛脅迫具有一定的適應性。從24 h 開始,較高濃度(0.6、0.8 和1 mg·L-1)重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的細胞密度明顯低于較低濃度(0、0.2 和0.4 mg·L-1)重金屬Cd2+處理下的細胞密度。隨著Cd2+濃度的提高,毒害作用增強,藻細胞密度下降。至實驗結束時(96 h),0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的細胞密 度分別為56.7×104、39.4×104、33.1×104、27.5×104、24.3×104和17.6×104個·mL-1。重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的細胞密度呈現出類似變化趨勢。隨著Pb2+濃度的提高,米氏凱倫藻細胞受到明顯的抑制。96 h時,0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的細胞密度分別為51.7×104、47.4× 104、43.9×104、31.5×104、26.2×104和18.9×104個·mL-1。結果顯示重金屬鎘和鉛脅迫對米氏凱倫藻的細胞生長產生毒害作用,但是兩者對米氏凱倫藻的毒害強度不同。實驗過程中根據線性回歸方程計算重金屬鎘和鉛對米氏凱倫藻96 h 半數抑制濃度(EC50),結果分別為0.684 和0.966 mg·L-1。

2.2 重金屬鎘、鉛脅迫對米氏凱倫藻光合色素含量的影響

重金屬鎘、鉛脅迫對米氏凱倫藻葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的影響情況如圖2所示。隨著Cd2+濃度的提高,葉綠素a和葉綠素b含量呈現降低的趨勢,而類胡蘿卜素含量呈現升高的趨勢。96 h 時,0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下的米氏凱倫藻葉綠素含量分別為0.35、0.35、0.28、0.23、0.15 和0.08 mg·L-1,葉綠素b 含量分別為0.08、0.12、0.05、0.03、0.02 和0.02 mg·L-1,類胡蘿卜素含量分別為0.13、0.13、0.25、0.31、0.45 和0.41 mg·L-1。隨著重金屬Pb2+濃度的提高,米氏凱倫藻葉綠素a 含量降低,葉綠素b 先降低后上升,類胡蘿卜素升高。96 h 時,0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下的米氏凱倫藻葉綠素a 含量分別為0.35、0.28、0.25、0.18、0.12 和0.11 mg·L-1,葉綠素b 含量為0.08、0.05、0.05、0.03、0.03 和0.14 mg·L-1,類胡蘿卜素為0.13、0.21、0.23、0.37、0.41 和0.44 mg·L-1。

圖1 重金屬Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對米氏凱倫藻細胞密度的影響 Figure1 Change of cell density of K.mikimotoi grown in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

圖2 重金屬 Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對米氏凱倫藻光合色素含量變化 Figure2 Change of photosynthetic pigment content of K.mikimotoi in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

2.3 重金屬鎘、鉛脅迫對米氏凱倫藻光合效率的影響

如圖3所示,重金屬鎘、鉛脅迫導致米氏凱倫藻的最大光能轉化效率降低。0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的最大光能轉化效率為分別0.59、0.52、0.52、0.47、0.38 和0.29;0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的最大光能轉化效率分別為0.52、0.50、0.44、0.39、0.29 和0.24。

2.4 重金屬鎘、鉛脅迫下米氏凱倫藻的抗氧化系統響應

2.4.1 重金屬鎘、鉛脅迫下米氏凱倫藻的超氧化物歧化酶(SOD)變化情況

0.4、0.6和0.8 mg·L-1濃度的重金屬Cd2+脅迫提高米氏凱倫藻超氧化物歧化酶(SOD)活性,其平均值分別較對照提高了約36%、40%和10%;同樣地,0.1、0.2 和0.4 mg·L-1濃度的重金屬Cd2+脅迫也一定程度上提高米氏凱倫藻超氧化物歧化酶(SOD)活性,其平均值分別較對照提高了約67%、42%和27%。

2.4.2 重金屬鎘、鉛脅迫下米氏凱倫藻的過氧化氫酶(CAT)變化情況

不同濃度重金屬鎘、鉛脅迫下米氏凱倫藻的過氧化氫酶(CAT)變化情況如圖5。米氏凱倫藻的過氧化氫酶(CAT)活性隨著重金屬Cd2+濃度的提高而增強;同樣地,米氏凱倫藻過氧化氫酶(CAT)活性隨著重金屬Pb2+濃度的提高而增強。0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的過氧化氫酶(CAT)活性平均值分別為0.53、0.59、0.81、12.8、19.1 和22.4 U·mg-1;0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的過氧化氫酶(CAT)活性平均值分別為6.10、9.49、15.68、23.15、24.58 和25.10 U·mg-1。

2.2.3 重金屬鎘、鉛脅迫下米氏凱倫藻的丙二醛(MDA)變化情況

重金屬鎘、鉛脅迫導致米氏凱倫藻的丙二醛(MDA)升高(圖6)。0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的丙二醛(MDA)較對照提高的幅度分別為39%、89%、115%、275% 和344%;0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的丙二醛(MDA)較對照提高的幅度分別為 47%、134%、160%、239%和282%。

圖3 重金屬Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對米氏凱倫藻最大光能轉化效率變化 Figure3 Change of maximal photochemical efficiency of K.mikimotoi grown in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

圖4 重金屬Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對米氏凱倫藻超氧化物歧化酶(SOD)變化 Figure4 Change of SOD activity of K.mikimotoi grown in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

圖5 重金屬Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對米氏凱倫藻過氧化氫酶(CAT)變化 Figure5 Change of CAT activity of K.mikimotoi grown in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

圖6 重金屬Cd2+(a)和Pb2+(b)處理對米氏凱倫藻丙二醛(MDA)變化 Figure6 Change of MDA activity of K.mikimotoi grown in different concentration of Cd2+ (a) and Pb2+ (b)

3 討論

因為藻細胞壁上帶有的負電荷以及羥基和氨基等官能團,會對含有正電荷的金屬離子有著較大的親和力,所以重金屬與微藻接觸時,首先是藻細胞對重金屬離子的吸附。高濃度重金屬脅迫會使得藻細胞表面的許多官能團會與金屬離子結合而喪失活性,進而影響藻的新陳代謝和生化反應過程,最終使藻生長受到抑制甚至死亡[9-10]。本研究中,隨著Cd2+和Pb2+濃度的提高,其對米氏凱倫藻細胞的毒害作用增強,藻細胞生長受抑制顯著。96 h 時,0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下的米氏凱倫藻細胞密度較對照分別下降了31%、42%、51%、57%和69%;0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下的米氏凱倫藻細胞密度較對照分別下降了8%、15%、15%、39%、49%和63%,表明不同金屬與藻細胞的結合吸附程度不同,表現出來的毒性也有所不同。根據線性回歸方程計算重金屬鎘、鉛對米氏凱倫藻的96 h 半數抑制濃度(EC50),結果分別為0.684 和0.966 mg·L-1,表明鎘和鉛都是對海洋微藻毒性較強的重金屬種類。

光合作用是綠色植物最基本和最重要的生命活動過程,葉綠素是植物進行光合作用的主要色素,其含量的高低在一定程度上反映光合作用的強度,是植物受環境脅迫的一個重要表征指標[11-12]。在本研究中,在較高濃度重金屬Cd2+脅迫下米氏凱倫藻的葉綠素a和葉綠素b含量降低,推測是由于重金屬進入藻細胞后,抑制了葉綠素酸脂還原酶等物質的活性,阻礙了葉綠素的合成;又或者是吸收進體內的重金屬跟葉綠體的蛋白質上的—SH 結合,或取代了Zn2+等,破壞了葉綠體的結構和功能活性,導致葉綠素含量降低[13]。類胡蘿卜素能將吸收的光能傳遞給葉綠素,是光合作用不可缺少的光合色素,同時,類胡蘿卜素也是植物一種重要保護劑。重金屬Cd2+和Pb2+脅迫下,類胡蘿卜素有明顯提高,推測這可能是米氏凱倫藻應對重金屬脅迫的一種適應機制,通過提高體內的類胡蘿卜素來降低重金屬Cd2+和Pb2+脅迫導致的傷害。葉綠素熒光是光合作用的良好指標和探針,通過對各種熒光參數的分析,可以得到有關光能利用途徑的信息,也可以反映植物受脅迫的情況[11]。研究結果發現,重金屬鎘、鉛脅迫下,米氏凱倫藻的最大光能轉化效率降低,96 h 時0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg·L-1重金屬Cd2+處理下米氏凱倫藻的最大光能轉化效率為分別0.59、0.52、0.52、0.47、0.38 和0.29;0、0.1、0.2、0.4、0.8 和1.6 mg·L-1重金屬Pb2+處理下米氏凱倫藻的最大光能轉化效率分別為0.52、0.50、0.44、0.39、0.29和0.24,表明重金屬脅迫使得藻PSⅡ反應中心受損,抑制了光合作用的原初反應,阻礙光合電子傳遞的過程。

丙二醛(MDA)是膜脂質過氧化的重要產物,它能交聯脂類、核酸、糖類及蛋白質從而對質膜結構和功能造成不良影響。MDA 含量的高低可以反映藻細胞膜脂過氧化的程度,同時也間接反映藻細胞的損傷程度[14-15]。本研究結果發現,重金屬脅迫下,藻細胞的MDA 含量增高,表明藻細胞膜透性增加,細胞膜系統受損,細胞結構遭到破壞。海洋微藻在遭受到重金屬脅迫,體內會產生過多的活性氧物質,使得活性氧的產生與清除處于一種非平衡狀態,此時微藻體內抗氧化系統就可能增強以清除多余的活性氧,從而減輕由活性氧積累產生的氧化傷害。保護酶體系SOD、CAT 是抗氧化酶防御系統中的重要保護酶,能夠在一定濃度重金屬污染范圍內對過氧化物起到清除作用,這可能是微藻對重金屬有一定抗性的主要原因之一[16]。本研究的結果顯示,較低程度的重金屬Cd2+和Pb2+脅迫下SOD 活性提高,表明較低濃度的重金屬離子能使機體抗氧化酶系統對其產生應激性,清除機體產生過多的自由基,相對活性增強,而隨著重金屬脅迫的增強,活性不再增強,甚至SOD 酶系統遭到了破壞,活性受到抑制。重金屬脅迫下,藻細胞的CAT 活性增強,有利于將SOD 酶反應產生的H2O2分解為H2O 和O2,對細胞起到保護作用,以減少重金屬脅迫對微藻的毒害效應。此外,還有研究表明,海洋微藻應對重金屬脅迫的生理生態機制還包括誘導或調節體內金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)等相關蛋白基因的表達等。金屬硫蛋白是一種富含半胱氨酸、熱穩定性、可誘導型非酶低分子量金屬結合蛋白,有研究表明大多數生物體內金屬硫蛋白分子結構,由兩個大小相近的結構域構成啞鈴型,兩個結構域通過賴氨酸殘基相連[17-18]。金屬硫蛋白的-SH 能強烈螯合有毒的游離金屬離子,減弱重金屬離子毒性,并可將之排出體外,其在必需金屬元素的調節和非必需金屬元素的解毒等方面起到重要的作用。