氣相色譜-串聯質譜法測定鮮香菇中25種有機磷類農藥殘留

戚文華　李鶯　王毅紅

摘 ? ?要： 建立了氣相色譜-串聯質譜測定香菇中25種有機磷農藥殘留的檢測方法。樣品用氯化鈉、乙腈提取，C18分散固相萃取凈化。采用EI源電離多反應監測（MRM）模式進行檢測，基質標準溶液校正，外標法定性、定量。分別討論了氯化鈉加入先后順序對提取效果的影響和C18的用量對凈化效果的影響。結果表明，25種化合物色譜峰分離度高，在各自的線性范圍內線性關系良好（r2 >0.99），在3個添加水平下的平均回收率為70.7%～116.6%，相對標準偏差（RSD）為4.4%～14.0%，方法的定量限為0.002～0.010 mg·kg-1。該方法簡單、快速，能保證批量樣品連續檢測的穩定性，適用于香菇樣品中多種有機磷類農藥殘留的同時檢測。

關鍵詞： 振蕩超聲提取; C18分散固相萃取; 氣相色譜串聯質譜; 有機磷農藥

Determination of 25 organophosphorus pesticide residues in shiitake by gas chromatography-tandem mass spectromety

QI Wenhua，LI Ying，WANG Yihong

（Zhengzhou Agricultural Product Quality Testing Center， Zhengzhou 450006，Henan， China ）

Abstract： A method was developed for the determinations of 25 organophosphorus pesticides in shiitake using gas chromatography-tandem mass spectrometry technique. The sample ware extracted by sodium chloride and acetonitrile. Then the extracts were purified by dispersive solid phase extraction with C18. The solvent extracts were analyzed by GC-MS/MS in the EI ion mode and multiple reaction monitoring（MRM）mode. The matrix standard solutions were used for calibration. External standard was used as the qualitative and quantitative method. The extraction effect of NaCl addition sequence and the purification effect of C18 dosage were discussed respectively. The results showed that 25 pesticides had good linearity within their respective linear range （r2 > 0.99），the average recoveries at three spiked levels ranged from 70.7 % to 116.6 % with the relative standard deviations（RSDs）from 4.4 % - 14.0 %. The limits of quantification of this method were in the range of 0.002 - 0.010 mg·kg-1. This method is simple，quick and has a good stability of the continuous batch analysis. It is suitable for determination of multiple organophosphorus pesticides in shiitake simultaneously.

Key words： Vortex and ultrasonic extraction; C18 dispersed solid phase extraction; Gas chromatography-tandem mass spectromety （GC-MS/MS）; Organophosphorus pesticides

香菇以其豐富的營養、宜人的味道[1]，受到越來越多人的青睞。我國香菇的種植面積也在逐年增加，但目前針對食用菌中農藥殘留檢測的標準較少[2]，GB 2763-2016《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中食用菌檢測方法大多情況要求參照蔬果類相關標準進行檢測[2-4]。NY/T 761—2008《方法一 蔬菜、水果中有機磷類農藥殘留檢測 GC-FPD法》做蔬果中有機磷類農藥殘留檢測不僅前處理步驟簡單易行，且GC-FPD儀器操作容易、選擇性強、靈敏度高，檢測成本低，檢測結果準確可靠，所以發布至今依然是蔬果中有機磷類農藥殘留定量檢測的首選方法[5]。但用此方法進行香菇中有機磷類農藥測定時，大多數樣品會出現嚴重的基質干擾，影響目標物色譜峰的定性定量[6-8]。

目前有關香菇中農藥殘留檢測的研究論述仍較少，其中以Quechers前處理-GC-MS/MS或LC-MS/MS 上機的檢測方法較新[7]，提取中多采用MgSO4除水，PSA+C18凈化[7，9-15]。但無水硫酸鎂遇水會大量放熱易使農藥分解，放熱過程不易控制[16]，且C18單獨使用的凈化效果未見報道。

筆者采用氯化鈉、乙腈為提取試劑，選擇甲胺磷等禁用、限用，甲基異柳磷等LC-MS/MS上響應差，敵百蟲等GC-MS/MS上不好測定的25種有機磷農藥為研究對象，討論了振蕩超聲提取法的提取效率，考察了C18的凈化效果，建立了分散固相萃取結合GC-MS/MS的定性定量分析方法，為菌菇類復雜基質樣品提供可靠的農殘檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

456-TQ氣相色譜串聯質譜儀（美國布魯克公司）;JM-B3002型百分之一電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）;N-EVAP型氮吹儀（美國Organomation公司）;UNIVERSAL 320型離心機（德國海蒂詩公司）;Multi Reax型多功能振蕩器（德國海道夫公司）;CH-300型超聲波（北京創新德超聲電子研究所）。乙腈、丙酮均為色譜純（德國Merck公司）;氯化鈉為分析純（天津科密歐有限公司）;無水硫酸鎂（Agilent公司）、C18 Endcapped（Agilent公司）;0.22 μm尼龍針孔濾膜（津騰公司）;

25種有機磷農藥標準品1 000 μg·mL-1均購自農業農村部環境保護科研監測所（天津）。用丙酮分別稀釋成80 μg·mL-1的儲備液，再稀釋成3組4 μg·mL-1的混合標準溶液于-18 ℃儲存，使用前用空白香菇基質溶液配制成所需濃度的25種農藥混合標準工作液。

1.2 樣品的制備

香菇樣品于2017年5月購自鄭州市農貿市場。取香菇整株，經四分法縮分后，用料理機絞碎充分混勻成漿狀。

1.3 樣品前處理

1.3.1 先加鹽振蕩超聲提取法 準確稱取（5.00 ± 0.02）g漿狀樣品于50 mL離心管中，加入3.0 g氯化鈉、10.0 mL乙腈，渦旋振蕩5 min超聲10 min。

1.3.2 振蕩超聲后加鹽提取法 按1.3.1稱取樣品，加入10.0 mL乙腈，渦旋振蕩5 min超聲提取10 min后，然后再加入3.0 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min。

1.3.3 凈化 樣品在5 000 r·min-1條件下離心5 min后，取上清液5.0 mL加入預先稱量好的盛有600 mg無水MgSO4和50 mg C18的10 mL離心管中，渦旋混勻5.0 min，離心5 min，再移取上清液2.0 mL于10 mL的玻璃離心管中，60 ℃水浴氮吹至近干，用丙酮準確定容至1.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜待測。

1.4 儀器參數設置

1.4.1 色譜條件 色譜柱：DB-17MS，50%聚苯基甲基硅氧烷柱，30 m×0.25 mm，0.25 μm;進樣口溫度260 ℃;進樣量1 μL;載氣氦氣;流速1 mL·min-1;升溫程序：初始溫度110 ℃，保持1.0 min;升溫速率20 ℃·min-1，到200 ℃，保持0.0 min;升溫速率10 ℃·min-1，到260 ℃，保持2.0 min;升溫速率5 ℃·min-1，到300 ℃，保持5.0 min;共26.5 min。

1.4.2 質譜條件 離子源：EI源，電離電壓70 eV;離子源溫度：200 ℃;碰撞氣：氬氣;傳輸線溫度：260 ℃，MRM掃描模式各參數見表1。

表1 25種有機磷類農藥監測離子對及保留時間

[編

號 農藥名稱 保留

時間/

min 定量離子對 定性離子對 碰撞能量/V 定量

離子 定性

離子 1 敵百蟲 4.47 185.0>93.0 185.0>63.0 10 15 2 甲胺磷 5.03 141.0>95.0 141.0>79.0 10 15 3 乙酰甲胺磷 6.51 136.0>94.0 136.0>42.0 15 10 4 滅線磷 7.25 158.0>97.0 158.0>81.0 18 15 5 治螟磷 7.57 322.0>146.0 322.0>266.0 10 10 6 甲拌磷 7.75 121.0>65.0 121.0>93.0 5 5 7 氧化樂果 7.99 156.0>110.0 156.0>79.0 10 25 8 特丁硫磷 8.15 231.0>129.0 231.0>97.0 50 50 9 二嗪磷 8.22 137.0>84.0 199.0>93.0 8 10 10 樂果 9.08 125.0>79.0 125.0>47.0 5 10 11 甲基對硫磷 9.93 263.0>109.0 263.0>127.0 10 5 12 毒死蜱 10.17 314.0>258.0 314.0>286.0 15 10 13 馬拉硫磷 10.23 173.0>99.0 173.0>127.0 18 10 14 殺螟硫磷 10.32 277.0>109.0 260.0>125.0 10 15 15 對硫磷 10.41 291.0>109.0 291.0>81.0 10 15 16 甲基異柳磷 10.73 199.0>121.0 199.0>93.0 5 20 17 倍硫磷 10.76 278.0>109.0 278.0>125.0 20 18 18 甲拌磷砜 10.94 153.0>97.0 153.0>125.0 10 5 19 水胺硫磷 11.07 136.0>108.0 121.0>93.0 10 5 20 丙溴磷 12.10 139.0>97.0 139.0>121.0 10 10 21 殺撲磷 12.39 145.0>85.0 145.0>58.0 10 15 22 三唑磷 15.03 161.0>134.0 161.0>106.0 5 10 23 伏殺硫磷 17.43 182.0>111.0 182.0>75.0 10 20 24 亞胺硫磷 17.68 160.0>133.0 160.0>77.0 10 25 25 蠅毒磷 19.95 362.0>109.0 362.0>226.0 15 15 ]

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

用丙酮作溶劑，分別配制25種有機磷農藥單一標準溶液進行MRM參數優化。對各個待測目標物的標準溶液進行母離子掃描，掃描范圍一般為50～500。獲得合適的母離子后再進行二級碎片掃描并優化碰撞能量，獲得響應值較好的兩個離子對，得出最優MRM掃描質譜條件。優化后各化合物母離子、子離子、碰撞能量參數見表1。

2.2 提取條件的優化

2.2.1 2種提取方式的回收率比較 采用2種提取方法，分別對香菇加標樣品（0.08 mg·kg-1，n=5）進行提取，經1.3.3步凈化后測定結果見圖1。1.3.1法25種有機磷農藥的回收率為49%～91%，相對標準偏差為5.3%～14.8%，1.3.2法回收率為70%～103%，相對標準偏差為2.9%～13.2%。1.3.1法與1.3.2法相比，敵百蟲、甲胺磷等19種化合物回收率較低在49%～68%之間，氧化樂果、甲基對硫磷等6種化合物的回收率在72%～91%之間。可能是先加鹽振蕩超聲的提取方法不能使含鹽樣品與乙腈充分混合，降低了乙腈的提取效率。

2.2.2 色譜峰干擾 考察2種提取方法得到的空白香菇基質配制的25種有機磷農藥（0.08 mg·kg-1）混合標準品MRM色譜圖。發現經1.3.2振蕩超聲后加鹽提取法提取得到色譜圖，24種化合物都獲得了較好的分離結果，而甲基對硫磷受基質干擾與雜質峰明顯重疊，如圖2-a所示。采用1.3.1先加鹽振蕩超聲提取法提取，該基質干擾峰響應明顯降低如圖2-b所示。從圖中可以看到，保留時間9.901 min處基質中未知峰基本消失，保留時間9.932 min處甲基對硫磷色譜峰峰形對稱無干擾。該方法甲基對硫磷回收率為77%，相對標準偏差為8.8%。說明采用先加鹽振蕩超聲提取法提取，保留時間9.901 min處未知峰提取效率較差，而甲基對硫磷能獲得較滿意的提取效率。

2.3 C18的凈化效果

C18是固相萃取中的常用試劑，可去除樣品中非極性干擾物，適用于果蔬中農殘檢測的凈化。根據QuEChERS方法中C18的常用量，分別選擇0、50、200、400 mg按1.3.3步驟進行凈化處理，考察C18的凈化效果。

向0.08 mg·kg-1加標水平下的香菇提取液中分別加入0、50、200、400 mg C18，每組5個平行樣品，每個樣品上機采集15針，每組共計75針。用對應C18量凈化后的空白香菇基質溶液配制的標準品單點定量，結果發現50～400 mg的C18都可以保證連續多針樣品檢測結果的重復性及穩定性，且3組樣品25種有機磷回收率平均值都在75%～108%之間，相對標準偏差均<8.3%。但不加C18凈化試劑，連續采集30針左右，樣品的重復性變差，因此本文采用50 mg C18作為其凈化試劑的用量。保證了連續進樣的穩定性，避免了儀器的頻繁維護，降低了檢測成本，也可滿足檢測要求。

2.4 基質效應

GC-MS/MS法檢測農藥殘留時，樣品基質成分會轉移到進樣口、毛細管柱頭等活性位點產生富集，最大限度地減少了目標物的吸附和分解從而產生較高的分析信號，導致農藥回收率通常會>100%，出現基質誘導增強效應。但另一方面GC-MS/MS進樣口、離子源易污染，污染后會引起色譜峰展寬、響應下降、重現性變差，甚至保留時間發生偏移。所以需綜合考慮基質效應帶來的影響。

筆者通過測定目標物在丙酮溶劑中的響應值（A，n=3），及在空白香菇基質溶液中的響應值（B，n=3），分析0.08 μg·mL-1濃度下，C18凈化后的香菇基質溶液中25種有機磷的基質效應ME/%=（B/A-1）×100。乙酰甲胺磷、亞胺硫磷2種ME>250，甲胺磷、氧樂果、樂果、殺撲磷、三唑磷、伏殺硫磷、蠅毒磷7種ME>100，其余16種ME在0～100%之間，說明香菇基質溶液中25種有機磷均具有明顯的基質增強效應，且基質效應差異顯著，這同陳曉水等[17]報道的QuEChERS前處理-GC-MS/MS檢測分析煙草樣品中有機磷類農藥的基質效應相符。

2.5 方法定量限、添加回收率、精密度及線性關系

在空白香菇試樣中分別添加濃度為0.01、0.08、0.32 mg·kg-1的25種有機磷農藥進行回收率試驗，每個添加水平5個平行樣，依步驟1.3.2（甲基對硫磷用方法1.3.1）、1.3.3、1.4方法進行檢測，基質標準溶液-外標法定量。結果見表2，25種有機磷的回收率為70.7%～116.6%，相對標準變差為4.4%～14.0%。以信噪比（S/N）≥10的添加濃度確定方法定量限（LOQ），都滿足歐盟栽培菌中有機磷農藥最低限量（0.01 mg·kg-1）的要求。

依步驟1.3.2（甲基對硫磷用方法1.3.1），1.3.3對空白香菇樣品進行處理，用得到的樣品基質溶液配制成6個質量濃度為0.002、0.005、0.02、0.08、0.20、0.40 μg·mL-1的25種有機磷農藥基質混合標準溶液。采用1.4的儀器參數進行分析，以峰面積y對質量濃度x做回歸方程y=kx+b。敵百蟲、滅線磷、對硫磷、殺撲磷等16種農藥在0.002～0.4 μg·mL-1范圍內線性關系良好，甲胺磷、乙酰甲胺磷、樂果、水胺硫磷等9種農藥在0.005～0.4μg·mL-1范圍內線性關系良好。25種農藥相關系數都在0.992 3～0.998 7之間。

3 討論與結論

香菇含有大量的多糖、嘌呤、核酸及含硫香味物質等，其成分復雜，不同的提取、凈化方式得到的樣液基質也不盡相同。單美娜[4]等采用乙腈超聲提取，氯化鈉鹽析分層，CleanertPC /NH2固相萃取柱凈化，結合PFPD檢測器檢測，建立了食用菌中22種有機磷類農殘檢測的固相萃取氣相色譜法。筆者對其提取方法進行了優化，簡化了稱樣量、提取試劑用量、超聲時間等條件，增加了渦旋振蕩的步驟使提取更充分。張愛芝[9]等在《QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定蔬菜中250種農藥殘留》文中考察了C18的凈化效果，提到C18的加入可使空白樣品的基線噪聲明顯降低，這與筆者在本試驗中對C18凈化效果的描述基本一致。

從本試驗結果可以看出，采用乙腈、氯化鈉振蕩超聲提取，C18分散固相萃取的前處理方法，結合GC-MS/MS分析技術，香菇基質溶液匹配標準品-外標法定量，可完成25種有機磷農藥的定性、定量分析。試驗發現提取過程中氯化鈉加入的先后順序可影響其提取效率，設計2種提取方案，對回收率、色譜峰干擾的數據進行比對分析。1.3.1先加鹽振蕩超聲提取法提取效率較低，敵百蟲、甲胺磷等19種化合物回收率在49%～68%之間，僅氧化樂果、甲基對硫磷等6種化合物的回收率在72%～91%之間可滿足一般農殘檢測回收率在70%～120%之間的要求。該提取方法甲基對硫磷處無明顯雜峰干擾，不影響其準確定性、定量。1.3.2振蕩超聲后加鹽提取法得到的色譜圖，24種化合物均得到良好的分離效果，且回收率在70%～103%之間滿足檢測要求，僅甲基對硫磷處有雜峰干擾，影響其準確定性、定量。因此，本文鮮香菇樣品中的有機磷農殘檢測，敵百蟲等24種化合物均采用1.3.2振蕩超聲后加鹽提取法進行提取，甲基對硫磷采用1.3.1先加鹽振蕩超聲提取法提取。

該方法簡單、快速，能夠保證批量樣品連續檢測的穩定性、準確性，為香菇這種復雜基質樣品中有機磷類農藥的檢測提供可靠的技術手段，可用于日常香菇生產種植及市場流通中有機磷類農藥殘留的普查監測。

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