噬菌體療法治療細菌性感染研究進展綜述

洪若軒

摘 要： 細菌性感染具有很高的致殘及致死率，對患者的健康和生命造成了嚴重威脅。然而抗生素的濫用使得細菌耐藥已成為臨床感染治療的一大棘手問題。隨著微生物學研究的不斷深入，科學界開始重新審視和評估噬菌體及其附屬產物——內溶素（Endolysin）的治療價值。據此，對活噬菌體制劑以及內溶素治療的研究歷程、相關改造方法以及發展方向進行綜述。

關鍵詞： 噬菌體療法;細菌性感染;內溶素

中圖分類號： F24????? 文獻標識碼： A????? doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2019.13.039

細菌性感染由于病情發展迅速，因此具有很高的致殘及致死率，對患者的健康和生命造成了嚴重威脅。目前，臨床所應用的體內抗菌方法主要是抗生素，而抗生素的濫用會引發嚴重的不良反應且會產生細菌耐藥現象，該現象已成為醫學界廣泛關注的問題之一。隨著現代科學技術的進步，科學家們開始尋找更有效的抑制耐藥細菌生長的手段，噬菌體療法因此進入了人們的視野。所謂噬菌體療法，是指利用活噬菌體或其分泌的一種水解酶——內溶素（endolysins）裂解細菌以治療病原菌感染的一種治療手段。噬菌體療法不僅對耐藥病原菌展現了良好的殺菌作用，同時具有良好的生物安全性，因而具有對抗細菌性感染的巨大潛力。

綜上所述，本文將針對噬菌體療法治療細菌性感染的研究進行綜述，展望其未來。

1 活噬菌體制劑的臨床應用可行性

早在20世紀20年代，科學家便利用活噬菌體制劑進行抗細菌感染的研究與臨床實驗，發現它具有諸多優勢。首先，噬菌體的宿主特異性強，即噬菌體僅針對與之對應的病原菌，不會破壞其他菌群;其次，噬菌體制劑治療效率高，即噬菌體在感染區域的以指數型速度進行增殖，因此制劑使用量低;最后，噬菌體制劑具有良好的生物安全性，由于噬菌體具有自限性，無法脫離細菌宿主而生存，因此一旦宿主消失，噬菌體便自行降解并排出體外，不會在體內滯留。從這些優勢可以看出噬菌體療法具有廣闊的臨床應用前景。

1.1 活噬菌體臨床前研究

近幾年來，多重耐藥菌種類不斷增加，“超級細菌”不斷出現。令人擔憂的是，研發新型抗生素的速度遠遠低于細菌對抗生素產生抗性的速度，因此開發新型的抗菌“藥物”迫在眉睫。而噬菌體因為對其宿主菌的特異性良好，不易產生耐藥性，使其在應對“超級細菌”感染中發揮了巨大作用，進入了研究者的視野。

革蘭陽性菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）以其高致病性和多重耐藥性成為人類健康的巨大威脅。Kishor等人構建SA感染兔模型，利用耐甲氧西林對SA進行髓內注射，使其感染兔骨髓，產生炎癥反應。他發現利用抗生素治療時，SA引起的骨髓炎在所有（100%）病例中都無法治愈。原因是細菌生物膜的形成使抗生素活性顯著降低，無法對細菌有效殺傷。而利用噬菌體療法，其在宿主細菌中產生的內溶素會降解宿主細菌生物膜，從而提高了治療效率。

此外，革蘭氏陰性菌作為醫內感染的主要病原菌類之一，對病人健康帶來了極大的威脅，亟需有效的抗菌手段。至今，部分研究表明活噬菌體制劑對動物革蘭氏陰性菌感染同樣有效，療效高于普通抗生素。如黃光濤研究了噬菌體在多耐藥鮑曼不動桿菌（drug resistant Acinetobacter Baumannii，AB）創面局部感染治療中的應用。在局部感染治療中，噬菌體Abp1能夠清除細菌、促使創面愈合。在全身感染治療中，噬菌體可以明顯提高小鼠存活率，整個 7 天的治療過程中噬菌體治療組未出現小鼠死亡，而陰性對照組存活率僅有7.1%。這說明噬菌體在抑制革蘭氏陰性菌感染方面亦具有一定效果。

1.2 活噬菌體臨床應用

隨著噬菌體療法在動物感染模型中療效顯著，人們將目光投向噬菌體療法的有效性，這是其臨床應用的前提。而一些科學研究也傳來了振奮人心的消息。如Wright等使用“噬菌體雞尾酒”（由6種噬菌體組成）療法在治療因耐藥性銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）引起的慢性中耳炎患者的研究表明，噬菌體治療后患者體內致病菌的數量顯著降低，病情得到改善，約25%的患者幾乎完全康復。

噬菌體療法的安全性也是其應用于臨床的必要條件，在一項由美國食品藥品管理局（ Food and Drug Administration， FDA）批準進行的Ⅰ期臨床試驗中，研究人員利用噬菌體療法抑制由PA、SA和大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）造成的慢性下肢靜脈潰瘍。在對這39例患者持續24周的治療中，研究人員未發現任何生物安全問題。另外，研究表明口服噬菌體亦具有良好的安全性，患者得到了有效治愈的同時，腸道正常菌群生長并未受到影響。

活噬菌體制劑在治療人類病原菌感染方面具有巨大發展前景，但也存在宿主譜過窄、耐藥性、噬菌體應用種類少、法律及倫理等問題。因此，活噬菌體制劑若要廣泛應用于臨床，仍有許多問題需要進一步探索和解決。

2 內溶素抑制細菌性感染的應用

隨著對噬菌體制劑的研究日益深入以及噬菌體克隆、純化技術的成熟日益進步，噬菌體自身編碼的細胞壁水解蛋白酶——內溶素（Endolysin）作為一種活噬菌體衍生物，其抑菌能力被科學家廣泛發掘。內溶素本身是噬菌體感染細菌后在裂解后期產生的一種裂解酶。它具有來源廣泛、不易產生耐藥性、較高的種屬特異性等明顯優勢。正因為如此，科學家將內溶素看作抑制細菌性感染的利器。

2.1 內溶素可用于抑制細菌性感染

自從1959年，Freimer等人首次證實噬菌體裂解酶具有殺菌能力以來，對內溶素治療細菌性感染可行性的研究不斷涌現。目前為止，已有大量體外研究表明，內溶素對多株腸球菌、SA、炭疽桿菌、豬鏈球菌、釀膿鏈球菌等革蘭陽性病原菌具有良好的殺菌作用。肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，SP）是引起兒童急性中耳炎、鼻竇炎、成人和老年人獲得性肺炎 （community-acquired pneumonia，CAP）的重要病原體，而CAP對大環內酯類等常用抗生素的耐藥性已演變為威脅人類健康的全球性問題， Stoffels等人利用轉基因萊茵衣藻分泌的抗SP內溶素進行裂解實驗，實驗結果表明，僅使用微量內溶素便可對SP進行有效殺滅，而利用傳統大環內酯類抗生素的治療過程中，有85%的SP產生了不同程度的耐藥性。這表明內溶素具有抑制革蘭氏陽性菌感染的能力。

內溶素除了能夠有效抑制細菌感染外，也具有良好的生物安全性。Witzenrath利用純化內溶素Cpl-1治療患有肺炎球菌肺炎的小鼠。結果表明，使用內溶素治療的小鼠均痊愈，且未產生任何消極反應。而Totte等用亦內溶素Staphefekt成功治愈了3名慢性或復發性SA皮膚病患者，未出現不良反應。這些結果表明內溶素具有良好的生物安全性。

2.2 內溶素的設計改造

人們從內溶素存在的兩大問題入手，對其進行目的性改造。由于革蘭氏陰性菌具有外膜，因此，當單獨把內溶素作為抗菌藥物時，卻對有外膜的陰性菌沒有作用。而內溶素的C端結合域具有較強的疏水性和重復的跨膜區，導致內溶素的水溶性差。為了克服這些缺點同時提高內溶素的裂解活性和宿主譜，科學家用分子生物學的方法對天然內溶素進行設計改造，使其成為優良的抗菌試劑。

2.2.1 針對革蘭氏陽性菌內溶素的設計改造

研究人員將多種內溶素進行融合以提高抗菌活性，如Becker等人將LysK-溶葡萄球菌素與SA噬菌體溶菌酶進行融合，生成三效融合酶PGH，使對MRSA的裂解能力提高了42-585倍。Rodriguez Rubio將SA噬菌體內溶素與幾種葡萄球菌溶素組成融合蛋白，提高了對葡萄球菌的裂解能力。Hamed為了改善內溶素的裂解能力和水溶性，合成了一種嵌合CHAP-酰胺酶。該酶在保持強裂解能力的同時具有良好的水溶性;拓寬內溶素宿主譜方面，Dong通過將不同的內溶素催化域與結合域結合組成嵌合酶，以達到同時抑制多種菌生長的能力。

2.2.2 革蘭氏陰性菌內溶素的設計改造

由于革蘭氏陰性菌沒有內溶素在裂解細菌時借助的穴蛋白，阻擋裂解酶與細菌細胞壁進行結合，使內溶素無法對革蘭陰性菌有效殺滅。因此，如何在體外直接裂解革蘭陰性菌是內溶素應用的又一重大挑戰。大量研究者為解決這一問題進行了大量的研究。如Lukacik等人針對應用于革蘭陰性菌的內溶素進行修飾改造，將細菌毒素FyuA上能特異識別鼠疫耶爾森氏菌細胞膜上離子通道的序列與T4內溶素融合，所得到的重組蛋白能借助離子通道通過鼠疫耶爾森氏菌的細胞膜，導致耶爾森氏菌的死亡，而且對E.coli也有明顯的殺滅效果。Larpin等人利用基因工程技術對大腸桿菌進行改造，使其合成一種由C末端陽離子肽和N-末端N-乙酰胞壁質酶結構域組成新型內溶素PlyE146，同時表現出了對PA和鮑曼不動桿菌的高效抗菌活性，有望成為抗生素的有效替代品。Briers等將能夠滲透細菌外膜抗菌肽SMAP.29融合在裂解酶 KZ144的N端，組合成融合蛋白SMAP29KZ144，這些融合蛋白通過E.coli表達純化后，能夠在其N端外膜滲透劑的幫助下通過細胞膜抵達細胞壁上的肽聚糖靶點，切割肽聚糖鏈鍵殺滅革蘭陰性菌PA，而且沿用這種思路設計的系列抗菌肽裂解酶對PA的體內殺滅效果已經在線蟲感染模型中得到了證實。另外，Zampara等人利用一種工程內溶素的新型方法——Innolysins構建出12種能夠參與大腸桿菌中的鐵富集運輸的噬菌體受體FhuA不可逆結合的內溶素，從而達到抗菌作用。其中，Innolysin#6不僅能夠裂解大腸桿菌，也顯現出了對其他具有FhuA同源物的革蘭氏陰性菌的抗菌活性。

綜上所述，相比于傳統抗生素，噬菌體內溶素作為一種新型的抗菌制劑具有諸多優點，因噬菌體為蛋白質，易純化，因此在工業化生產方面亦具有潛在優勢。

3 總結與展望

隨著對噬菌體制劑和內溶素研究的不斷深入，活噬菌體制劑療法與內溶素療法已展現出抗生素所不具有的優點，而且有些單一噬菌體與抗生素聯用具有更強的能力。例如，Dalmasso等發現，環丙沙星與APCEc03噬菌體聯用的殺菌效果優于噬菌體雞尾酒或混用抗生素的雞尾酒制劑，環丙沙星刺激了噬菌體活性，提高了其裂解細菌的能力。而Gilmer等人的研究也表明，內溶素與抗生素能產生協同作用。因此，研究不同抗生素與新型噬菌體及內溶素聯用可為臨床治療細菌性感染提供更好的保障。另外，還有研究表明，噬菌體與部分動物細胞在體內以共生態的形式存在，即噬菌體為宿主提供粘膜區域的抗菌保護，宿主為噬菌體提供穩定寄主來源。這也由此產生了假說，即包括人類在內部分動物的體細胞將噬菌體作為一種抗菌手段。若有更多研究證實此觀點，則可以說明沒有任何一種治療細菌性感染的手段比利用活噬菌體及其衍生物治療更加行之有效，這也顯示出活噬菌體及其衍生物療法具有廣闊前景。

然而，目前噬菌體療法并未得到廣泛利用。其中一個問題便是噬菌體及其衍生物的安全性。雖然噬菌體在人體內作為無處不在的共生體這一事實可間接顯示噬菌體療法的安全性，但是尚需要進一步的臨床研究來進一步證明。除此以外，還有一個備受關注的問題，即細菌對噬菌體的耐藥性。在細菌與噬菌體共同進化的過程中，細菌演化出了一系列對抗噬菌體感染的機制，如改變表面噬菌體吸附受體，利用多糖遮掩受體，利用限制性內切酶修飾噬菌體DNA等。而噬菌體也可利用反防御機制抵抗噬菌體的耐藥性。這種共同進化受到環境，變異等多方面的影響，直接影響噬菌體的抗菌效果。

因此，未來的研究方向應放在證明噬菌體的安全性上，并關注噬菌體療法在復雜環境中的進化結果，提供有關如何限制細菌對噬菌體抗性進化的依據。相信未來會有更多關于噬菌體治療的研究涌現，解決目前存在的問題。相信活噬菌體及其衍生療法在諸多科研人員的研究推動下，終將會成為抑制病原性菌株感染的有力手段。

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