巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長動力學模型的研究

魏釗異，方婷，李長城，彭亞博，李曉婷，潘潔茹，葉海梅，林侃

（1.福建農林大學食品科學學院,福州350001；2.福州市疾病控制預防中心，福州350004）

0 引 言

單核細胞增生李斯特菌（Listeria m onocytogenes，LM）是一種常見的能引起人畜共患病的革蘭氏陽性短桿菌，可使人患腦膜炎、敗血癥、流產早產等疾病，危害嚴重。與其他食源性致病菌相比，由LM引發的李斯特菌病爆發幾率相對較低，但其致死率卻高達20%～30%[1]。世界衛生組織（W orld Health O rganization,W HO）指出，包括蔬菜、奶及奶制品、肉制品在內的消費性食品，都受到不同程度的污染[2]，特別是在乳制品中普遍存在[3]。

巴氏殺菌奶采用低溫殺菌技術，能最大限度保證牛奶的營養成分不致流失，所以越來越受到消費者的喜好,占液態奶銷量的50%左右[4]。LM在低溫（0～4℃）下仍能生長，是一種典型的耐冷細菌。并已有報道顯示，LM能夠耐受巴氏消毒，對生鮮乳、巴氏殺菌乳等相關乳制品造成食用風險[5]。2007年11月，美國馬薩諸塞洲發生了一起由當地牛奶場生產的巴氏消毒乳引起的單增感染的暴發，造成5人感染，3人死亡[6]。

預測微生物學是以計算機為基礎，描述特定環境下微生物的生長、存活和死亡的情況，建立數學模型，從而為風險評估提供基礎。國內外已有較多關于食品中單增李斯特菌的預測模型的研究。Li[7]研究5～30℃鹽漬與未鹽漬的三文魚魚籽中單增李斯特菌的生長動力學，結果表明，利用Ratkowsky平方根模型擬合得到的三文魚魚籽樣品中單增李斯特菌理論上的最低生長溫度為-0.5℃，與FDA報道的水產品中單增李斯特菌最低生長溫度（-0.4℃）非常接近。Fang[8]等人研究鮮切哈密瓜中單核增生李斯特菌和背景微生物的生長動力學，得出Arrhenius-type模型提供更準確的估計單增李斯特菌在溫度(＜4℃)條件下的生長速率。鄒宇[9]等研究5、12、25、35℃牛奶中單增李斯特菌的預測模型，確定Gompertz方程為其在牛奶中的最優初級模型，并采用Belehradek方程描述溫度對其最大生長速率和延遲時間的影響。

目前，尚未見有關巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長及其預測微生物學方面的報道。因此，本文擬用巴氏殺菌奶為原料，主要目的是通過初級模型和二級模型來描述單增李斯特菌在4～43℃范圍內（4、8、12、16、20、25、30、37、40℃和43℃）的生長，并建立描述其生長規律的數學模型，以期為相關食品監管部門開展巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的風險評估提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴氏殺菌奶：市售，袋裝，產品標注的保質期為0～4℃下5 d。

單增李斯特菌菌株（CICC21632、CICC21633、CICC21635、CICC21639）購買于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、PALCAM瓊脂、腦-心浸出液肉湯（BHI）、蛋白胨粉：廣東環凱微生物科技有限公司；利福平：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AIRTECH生物安全柜：蘇州安泰空氣技術有限公司；H-1850R高速冷凍離機：湖南相儀實驗室儀器有限公司；SHP-250細菌生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；KB115低溫恒溫箱：德國BINDER公司；VORTEX-5漩渦混合器：上海習仁科學儀器有限公司；DX-200高壓滅菌器：德國Systec公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌培養及接種菌液的制備

參照Fang[8]的方法，活化、培養及制備單增李斯特菌混合接種母液，并通過梯度稀釋，使單增李斯特菌濃度達5.5 log CFU/mL，備用。

1.3.2 巴氏殺菌奶樣品的準備與接種

以無菌操作，將巴氏殺菌奶分裝到無菌試管中，每管10 mL，備用。將100μL單增李斯特菌混合菌液接種到每個無菌試管中，并充分震蕩均勻放入一定溫度的培養箱中培養。

1.3.3 生長試驗與計數

將已接種的樣品分別放置于4，8，12，16，20，25，30、37、40和43℃的恒溫培養箱中培養，按照預設的時間間隔取樣，測定單增李斯特菌菌落數，其中每個溫度條件設置10～14個取樣點。用PW梯度稀釋每個樣品，參照Fang[8]的方法采樣計數。

1.3.4 初級模型

分別采用Baranyi模型[10]和Huang模型[11]擬合各個溫度對應的單增李斯特菌生長數據，其中Baranyi模型的表達式如式（1）和（2）所示，Huang模型的表達式如式（3）和（4）所示。

Y0，Ymax為初始菌濃度和穩定期菌濃度/(ln CFU/g)；

μmax為比生長速率/(h-1)；

t為時間/h；

λ為遲滯期；

h0為反應細菌所處的生理狀態，且h0=λμ；

α為常數(=4)，定義細菌生長時由遲滯后期向對數期轉化。

1.3.5 二級模型

分別采用Ratkowsky平方根模型[12]、Huang平方根模型[13]和Cardinal模型[14]，評價溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率的影響，3種二級模型的表達式分別為式（5）～（7）。

式中：T0為最低生長溫度/(℃);

T為細菌所處的環境溫度/(℃)；

μmax為比生長速率/(h-1)；

Topt為最適生長溫度/(℃)；

μopt為最適溫度下的最適生長速率/(h-1)；

a、b為常數。

1.3.6 數據擬合與分析

本研究采用預測微生物學專用軟件IPM P 2013[15]對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長數據進行擬合處理。采用方差分析（ANOVA）分析比較各個模型參數之間的差異，由此選擇最優模型。

1.3.7 驗證試驗

采用預測微生物學專用軟件IPM P擬合得到各個模型的最低生長溫度，做恒溫驗證試驗。將巴氏殺菌奶中接種單增李斯特菌后，放置在得到的最低生長溫度恒溫培養4天后，取樣、計數。

2 結果與分析

2.1 巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長特點

在各恒定溫度生長試驗中，單增李斯特菌的初始接種量為5.0-5.5 log CFU/g，單增李斯特菌的生長曲線均表現出遲滯期、對數期和穩定期3個階段。在試驗溫度（4～43℃）范圍內，其生長速率呈現出先增大后降低的變化。在低溫（4～8℃），其生長速率較低；當溫度達到37℃，其生長速率達到最大；當溫度達到40℃后，其生長速率又開始降低。

圖1 巴氏殺菌奶中單增李斯特菌（LM）在不同溫度下（4～43℃）的生長曲線

2.2 初級模型比較分析

將各恒定試驗溫度下單增李斯特菌所獲得的生長數據都可以用Huang模型和Baranyi模型來擬合，所得到的擬合曲線如圖1所示。除了對遲滯期和對數期向穩定期的轉折點的描述有差異外，2種模型均能較好地擬合巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長情況。統計參數RM SE、RSE、AIC值是衡量模型擬合精確度的重要指標，一般來說，其數值越小，模型擬合的精確度越高。表1列出了2種初級模型的RM SE、RSE、AIC值，兩種模型的RM SE、RSE、AIC值在同一統計量取值較為接近，無顯著差異，可以認為2種模型對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長曲線均具有良好的擬合精度。

表1 巴氏殺菌奶中單增李斯特菌2種初級模型相關參數

在4～43℃時，Huang模型中，單增李斯特菌的μmax隨著溫度的增加，由0.017增加到1.024達到最大，當到40℃后開始降低為0.743，43℃為0.498。Baranyi模型中，單增李斯特菌的μmax隨著溫度的增加，由0.017增加到1.005達到最大，當到40℃后開始降低為0.721，43℃為0.512。比較擬合得到的H uang模型和Baranyi模型估算得到的單增李斯特菌生長速率之間的關系，回歸直線的斜率為0.9994（如圖2所示），R2＞0.99，表明由這兩種模型估算出的單增李斯特菌生長速率無顯著差異，進一步驗證了2種初級模型對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長具有同等擬合效果。

圖2 Huang模型和Baranyi模型比生長速率之間的比較

由單增李斯特菌的生長特性可以知道，其耐低溫，在4℃的環境下仍然可以生長。劉珊娜[16]等人研究冷藏牛奶中單增李斯特菌的生長情況，發現即使是在冷藏條件下，單增李斯特菌達到穩定期的菌數有2 lg CFU/m L的增長。分析其原因是牛奶不但營養豐富，水分含量高，且pH接近中性，從而有利于微生物的生長繁殖；鄒宇[9]等也研究了單核細胞增生李斯特菌在牛奶中的生長預測模型，結果也證實該菌在4℃的環境中仍可生長繁殖，且在5、15、25和35℃4種不同溫度下的最大比生長速率分別是0.050、0.170、0.350和0.600。綜上發現，冷藏食品LM污染的風險很高，而牛奶也給其繁殖提供了有利條件。巴氏殺菌奶須低溫儲藏，在本試驗中，將其放置4℃進行恒溫實驗，其生長速率為0.017，達到穩定期后單增李斯特菌的菌數也有1 lg CFU/m L的增長。

2.3 二級模型比較分析

圖3 3種二級模型描述溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率影響的擬合曲線

通過初級模型（H uang模型和Baranyi模型）擬合得到巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長速率無顯著性差異，所以可以將兩組生長速率的數據進行合并，建立溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率影響的二級模型。圖3是表明3種二級模型（R atkow sky平方根模型、Huang平方根模型、Cardinal模型）均可以用于描述溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率的影響。表2列出了Ratkow sky平方根模型、H uang模型、Cardinal模型模擬單增李斯特菌在巴氏殺菌奶中二級生長模型的相關參數。

表2 巴氏殺菌奶中單增李斯特菌2種二級模型相關參數

由表2可知，由R atkow sky平方根模型、Huang平方根模型和Cardinal模型擬合得到的巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的最低生長溫度和最高生長溫度分別為：0.218、2.733、2.99和46.389、45.755、44.692℃，3種預測模型擬合出來的最高生長溫度很接近。根據國際微生物標準委員會（ICSM F）的報道，單增李斯特菌的最低、最適、最高生長溫度分別為-0.4，37℃和45℃[17]。Ratkow sky平方根模型推導出的單增李斯特菌的理論最低生長溫度為0.218℃，與ICSM F的報道更為接近，但最高生長溫度比報道的要高；Huang平方根模型和Cardinal模型預測的最低生長溫度分別為2.733℃和2.99℃，都高于了ICSM F報道的最低生長溫度；Huang平方根模型最高生長溫度為45.755℃，略高于報道的溫度，而Cardinal模型的最高生長溫度為44.692，比報道的溫度要略低。由此結果開展了驗證實驗，將接種單增李斯特菌的巴氏殺菌奶放置0.2℃恒溫培養4天后取樣、計數，發現巴氏殺菌奶中單增李斯特菌增長了約0.4 Log，由此可知，Ratkow sk平方根模型更適合描述溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率的影響。

3 結 論

本文研究在4～43℃恒定溫度條件下，巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長動力學模型，發現接種的單增李斯特菌在巴氏殺菌奶，放在低溫（4℃）條件下仍能生長，并發展成為完整的生長曲線，所有的曲線都包含有滯后期，指數期和穩定期。使用Huang模型和Baranyi模型作為初級模型，對各個恒定溫度得到的生長數據進行擬合，綜合分析比較RM SE、RSE、AIC值和生長速率，結果表明兩種初級模型無顯著差異，均適合用于描述巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的生長狀況。

使用R atkow sky平方根模型[12]、Huang平方根模型[13]和Cardinal模型[14]作為二級模型，分析溫度對于單增李斯特菌生長速率的影響。結果表明，三種模型都可以描述溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率的影響。R atkow sky平方根模型推導出的單增李斯特菌理論最低生長溫度為0.218℃，與食品中的最低生長溫度相符。因此，Ratkow sky平方根模型更適合描述溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長速率的影響。本文研究了溫度對巴氏殺菌奶中單增李斯特菌生長動力學的影響，并測算了數學模型在預測微生物生長速率方面的應用。研究所建立的模型可為相關食品監管部門開展巴氏殺菌奶中單增李斯特菌的安全風險評估提供科學基礎。