嗜熱鏈球菌發酵特性比較與分析

陸嘉誠，關成冉，張臣臣，陳大衛，李啟明，王震，顧瑞霞，遲濤

(1.揚州大學食品科學與工程學院江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225127；2.新希望乳業股份有限公司，成都610023；3.黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱150030）

0 引 言

嗜熱鏈球菌作為生產發酵乳的重要菌種[1]，被歐洲食品安全局認定具有安全資格[2-3]，其重要性僅次于第一位的乳酸乳球菌[2]。現代乳制品產業多采用的固定菌株，酸奶發酵劑的單一化，導致產品種類不足。由于國內乳制品企業使用的發酵劑菌株主要依賴于進口，相關的研究技術、知識產權等幾乎完全被國外的廠家壟斷。因此，篩選具有完全自主知識產權的優良菌種作為發酵劑成為亟待解決的問題[4]。

本研究以實驗室分離保藏的11株嗜熱鏈球菌為研究對象，考察其產酸能力以及發酵乳的活菌數、粘度、持水力、質構和風味等指標，并采用主成分分析法對菌株進行評分，以期選出一株具有良好發酵性能的嗜熱鏈球菌。

1 實 驗

1.1 材料與設備

脫脂乳粉，全脂乳粉。嗜熱鏈球菌菌株來源：揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室凍藏保存。

SPX-250B型生化培養箱，Trace DSQ氣相色譜-質譜聯用儀，GYB60-08高壓均質機，Legend mach1.6R高速冷凍離心機，FE20型p H計，RVD-Ⅶ黏度測定儀。

1.2 方法

（1）乳酸菌活化。將乳酸菌接種于新配置滅菌后的12%脫脂乳培養基中，混勻后42℃培養至凝乳，活化三代。

（2）發酵乳制備。全脂牛乳（質量分數12%）→加入蔗糖→均質（20 M Pa，60℃）→90-95℃熱處理5 min→冷卻至42℃→接菌→42℃發酵→4℃冷藏。

（3）酸度測定。以質量分數為0.5%酚酞作為指示劑，用濃度為0.1 m ol/L的N aOH標準溶液滴定。樣品取3個平行，取其平均值。

（4）p H值測定。用p H計測定發酵乳的p H值。

（5）持水力測定。取發酵乳樣品10 g至離心管中，室溫下離心，轉速3 500 r/min，離心15 min。傾去離心管中上清液，將離心管倒置10 min后立即稱重，并按以下公式計算：

（6）活菌數測定。吸取1 m L發酵液至9 m L質量分數為0.9%生理鹽水中。振蕩混勻后采用10倍稀釋，吸取1 m L稀釋液進行平皿傾注，42℃恒溫培養72 h，測定發酵乳中嗜熱鏈球菌的活菌數。

（7）黏度測定。將發酵乳用玻璃棒正反方向各攪拌5次調整溫度至4℃，采用RVD-Ⅶ黏度儀測定發酵乳樣品的黏度，每個樣品平行測定3次，取平均值。

（8）質構測定。利用TM S-PRO質構儀，具體參數：12.7 mm圓柱探頭，觸發力0.05 N，測試速度60 mm/min，形變量20%，利用軟件測定算得到樣品的硬度、內聚性等指標。每個樣品做3次平行實驗。

（9）乙醛和雙乙酰質量濃度測定。樣品中雙乙酰質量濃度測定參考文獻[5]中的研究方法。樣品中乙醛質量濃度測定參考文獻[6]中的研究方法。

1.3 數據分析

使用O rigin Pro8.5和SPSS21.0軟件進行作圖和數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同嗜熱鏈球菌產酸能力比較

將活化好的11株嗜熱鏈球菌按3%接入滅菌脫脂乳（質量分數12%）中，42℃發酵，發酵6 h過程中pH值和酸度變化如圖1所示。發酵初期1.5 h內，11株菌的p H值和酸度變化趨勢平緩，尤其是R 704-2和RM 34-2。1.5～3 h間樣品的p H值下降迅速，介于0.6～1.15之間，滴定酸度急劇增加，平均酸度增長量達到28.49°T。3～4.5 h期間，pH值下降幅度開始變小，介于0.26～0.66之間，平均酸度增長量達到18.32°T。由圖(1)b可以看出，393-2，937，grx02，394-1，克菲爾-8，XPL-1-4，RM 34-2這7株菌在6 h達到發酵終點，平均產酸速率都達到11°T/h，其余4株菌的平均產酸速率低于10°T/h，其中393-2的產酸速率最高，為12.83°T/h；grx90的產酸速率最低，為6.85°T/h。

2.2 不同嗜熱鏈球菌發酵乳黏度比較

圖1 不同嗜熱鏈球菌在發酵過程中的變化

黏度是反映發酵乳品質優劣的重要指標之一，有研究表明，發酵乳黏度主要是因為嗜熱鏈球菌在發酵過程產生胞外多糖，胞外多糖多聚物作為增稠劑、膠凝劑增加了發酵乳的黏度且有助于改善發酵乳的組織狀態[7]。對11株嗜熱鏈球菌發酵乳黏度進行測定，由圖2可以看出，不同嗜熱鏈球菌發酵乳的黏度差異較大。grx02，XPL-1-4，394-1，克菲爾-8和YF-miX發酵乳的黏度介于3 000～5 000 M Pa·s；RM 34-2，822-1和grx90發酵乳的黏度介于5000～10 000 M Pa·s；393-2和R 704-2發酵乳的黏度介于15 000～20 000 M Pa·s；937發酵乳的黏度最高為23 982 M Pa·s。

圖2 11株嗜熱鏈球菌發酵乳黏度

圖2中，標注不同字母表示數據存在差異（P＜0.05），下同。

2.3 不同嗜熱鏈球菌發酵乳持水力比較

持水力也是發酵乳品質的一個重要評價指標，持水力是衡量發酵乳經離心處理后所能保留的水分的能力，大部分是與凝膠分子結合較牢的水分，可以較大程度的影響發酵乳的風味和組織形態。衛曉英等[8]研究表明，持水力過低會導致乳清析出，從而直接影響發酵乳的組織狀態與口感。由圖3可以看出，grx90，394-1，grx02，393-2和YF-miX發酵乳的持水力低于60%，而其他6株菌發酵乳的持水力超過60%，其中R 704-2發酵乳的持水力最高，達到66.93%。除394-1發酵乳外，其余10個發酵乳樣品持水力均在50%以上，優于高微娟[9]、張睿[10]的報道，說明持水力較好，可用于發酵乳制品生產。

圖3 11株嗜熱鏈球菌發酵乳持水力

2.4 不同嗜熱鏈球菌發酵乳活菌數比較

乳酸菌活菌數是評價發酵乳功效的主要指標之一[11]，Kum ar和Shah等人[12-13]認為酸奶中發酵劑的活菌數應該達到1×109m L-1，國標對發酵乳最低活菌數的規定是1×106m L-1。對11株嗜熱鏈球菌發酵乳活菌數進行測定。由圖4可知，不同菌株發酵的樣品活菌數差異較大，grx90發酵乳中活菌數最低，為7.76×107m L-1；grx02、YF-miX達到1×108m L-1；其他8株菌活菌數均達到1×109m L-1，說明這8株菌具有良好的活力，可作為潛在的發酵劑菌株用于發酵乳的生產。

圖4 11株嗜熱鏈球菌發酵乳活菌數

2.5 不同嗜熱鏈球菌發酵乳質構比較

質構特性是發酵乳的一項重要品質指標，不僅可以表示產品的組織狀態、口感等，還能進一步反映產品的質量穩定性[14-15]，對11株嗜熱鏈球菌發酵乳質構進行測定。由表1可知，11個發酵乳樣品的硬度差異顯著，硬度是衡量凝膠強度的主要參數，硬度越大表明凝膠的網絡結構越緊密，抗形變能力強，937，XPL-1-4，RM 34-2和克菲爾-8發酵乳的硬度都達到了0.2 N，說明發酵乳內部結構較其他樣品更緊密。比較樣品的內聚性可以看出：11個樣品的內聚性差異顯著，其中394-1和grx90發酵乳的內聚性達到0.6R atio，說明發酵乳的凝膠網絡結構更好。

表1 發酵乳質構測定結果

2.6 不同嗜熱鏈球菌發酵乳乙醛、雙乙酰質量濃度比較

酸奶中，乙醛質量分數決定產品質量的好壞，它能賦予酸奶良好的芳香味[5]，不同菌株產乙醛量不同，由圖5可以看出，有3個發酵乳樣品的乙醛質量濃度達到20 m g/L，393-2產乙醛的能力最強，為26.99 m g/L。其余8個發酵乳乙醛質量濃度介于13.79～19.51 m g/L，RM 34-2產乙醛能力最弱，為12.91 m g/L。Sandine[16]等研究發現只有發酵乳中乙醛濃度超過8 m g/L，才能賦予產品良好的風味，而當發酵乳中乙醛質量濃度超過30 m g/L時會產生令人不愉快的氣味。由此可知這11株菌均可賦予發酵乳良好的風味。雙乙酰也是發酵乳的主要風味物質，能夠賦予發酵乳奶油香味。由圖6可以看出，11個發酵乳雙乙酰的質量濃度介于4.54～8.06 m g/L，grx90產生的雙乙酰濃度最低，XPL-1-4產生的雙乙酰質量濃度最高。

圖5 11株嗜熱鏈球菌發酵乳乙醛、雙乙酰質量濃度

3 結果與分析

嗜熱鏈球菌發酵特性評價指標的單位不同，量程大小不一，對8個評價指標的原始數據進行標準化處理，可避免不同單位和量程不一的影響。表2為經過標準化處理后的各項數據。

主成分分析用少量的因素來描述多種指標素之間的關系[17-18]。本研究利用SPSS 21.0軟件進行主成分分析，對11株嗜熱鏈球菌產酸速率以及發酵乳的硬度、內聚性、黏度、活菌數、持水力、雙乙酰質量濃度和乙醛質量濃度等8個指標進行數據轉換和降維。由表3得出主成分及方差貢獻率，第1、2、3主成分累計貢獻率可以達到86%以上，說明用這3個主成分能較好

表2 8個評價指標的標準化數據

表3 總方差解釋

地代替上述8項指標來評價嗜熱鏈球菌。

得分系數表示各個指標對主成分的影響程度，通過得分系數可以將各個變量進行線性組合，建立第1主成分（Y 1）、第2主成分（Y 2）、第3主成分（Y 3）與硬度（X 1）、內聚性（X 2）、持水力（X 3）、黏度（X 4）、活菌數（X 5）、雙乙酰質量濃度（X 6）、乙醛質量濃度（X 7）和產酸速率（X 8）這8個變量的得分系數模型：

第1主成分可提取為Y 1=0.245X 1-0.318X 2+0.248X 3-0.163X 4+0.285X 5+0.026X 6-0.188X 7+0.069X 8；

第2主成分可提取為Y2=-0.015X 1+0.020X 2-0.271X 3-0.007X 4-0.046X 5+0.268X 6+0.565X 7+0.369X 8；

第3主成分可提取為Y 3=0.017X 1+0.220X 2+0.202X 3+0.823X 4-0.145X 5+0.252X 6+0.035X 7-0.167X 8。

為了對比菌株發酵性能之間的差異，對菌株進行綜合評價。由方差貢獻率和主成分函數表達式，可得綜合評價函數：Y=0.45Y 1+0.24Y 2+0.17Y 3。由表5可知，嗜熱鏈球菌937的各主成分得分Y 1和Y 2均比其他

表4 主成分提取結果及成分得分系數

表5 綜合因子得分

菌株的得分高，比較各菌株的綜合因子得分Y可知，嗜熱鏈球菌937的綜合得分Y明顯高于其他菌。

針對11株嗜熱鏈球菌進行了產酸速率以及發酵乳的黏度、持水力、活菌數、乙醛和雙乙酰濃度等指標的測定。通過主成分分析，從11株菌中選出了一株具有產酸速率快，發酵性能良好的嗜熱鏈球菌XPL-1-4。從綜合得分來看XPL-1-4的得分高于其他菌株，實驗結果表明，嗜熱鏈球菌XPL-1-4可以作為發酵乳開發的優良菌種。